許賢恩，王仁鳳，王亞軍

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所，浙江 杭州 310014；2.生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程研究中心，浙江 杭州 310014)

生物催化正迅速成長為生物技術(shù)應(yīng)用的主導(dǎo)方向[1]，是現(xiàn)代綠色化學(xué)加工業(yè)的重要組成部分，對(duì)化學(xué)工業(yè)技術(shù)進(jìn)步起著重要的作用[2]，越來越多的化學(xué)品采用生物催化技術(shù)來合成。但是生物酶法催化反應(yīng)體系中往往含有大量的酶蛋白、催化細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)容物、細(xì)胞碎片等而導(dǎo)致后續(xù)產(chǎn)物回收困難，溶劑萃取時(shí)則會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象，降低后續(xù)提煉產(chǎn)物的提取收率。因此，需要通過一些措施去除轉(zhuǎn)化液中的菌體及蛋白質(zhì)。工業(yè)生產(chǎn)中往往采用活性炭吸附過濾的方法，該方法方便易行，但是大量蛋白質(zhì)或菌體細(xì)胞的存在會(huì)使濾餅極其粘滯，堵塞濾孔而中斷過濾，因而下游的生物轉(zhuǎn)化液中的產(chǎn)物分離回收成為生物酶法催化生產(chǎn)工藝開發(fā)的一個(gè)棘手問題。

混凝現(xiàn)象是指微粒凝結(jié)現(xiàn)象，包括凝聚和絮凝現(xiàn)象。在發(fā)酵領(lǐng)域中，混凝技術(shù)主要應(yīng)用于生化產(chǎn)品的制備過程中的菌體回收[3]，菌體、蛋白去除。通過菌體混凝技術(shù)提高產(chǎn)品的產(chǎn)量，其工作原理是添加混凝劑使顆粒細(xì)小的膠體、菌體細(xì)胞、細(xì)胞碎片、殘留培養(yǎng)基等固形物凝聚成較大的顆粒，易于沉降，從而更有利于發(fā)酵液的固液分離，極大的降低了固液分離的成本[4]。但是鮮有文獻(xiàn)報(bào)道高細(xì)胞濃度的生物轉(zhuǎn)化液中的菌體及蛋白質(zhì)的去除方法。本文考察了混凝和破乳技術(shù)應(yīng)用于生物催化法合成1-氰基環(huán)己基乙酸、阿托伐他汀關(guān)鍵手性前體6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯、1-氰基環(huán)己基乙酸生物轉(zhuǎn)化液中菌體、蛋白質(zhì)去除的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器

試劑：6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯由浙江新東港藥業(yè)股份有限公司饋贈(zèng)，6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)室自制；1-氰基環(huán)己基乙腈、1-氰基環(huán)己基乙酸由浙江手心醫(yī)藥化學(xué)品有限公司饋贈(zèng)。其余各種試劑均為市售分析純。

UV-2000型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司，中國上海。Leica DM4000 B生物顯微鏡，德國。

1.2 生物轉(zhuǎn)化液制備

低粘度生物轉(zhuǎn)化液A：1-氰基環(huán)己基乙酸的生物轉(zhuǎn)化液，含有底物約為150 g/L的1-氰基環(huán)己基乙酸腈（固體，不易溶于水），菌體含量16 g DCW/L，攪拌反應(yīng)7 h轉(zhuǎn)化率95%以上，無其他添加物。

高粘度生物轉(zhuǎn)化液B：6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯生物轉(zhuǎn)化液，制備過程參考文獻(xiàn)[5]，含有約200 g/L 6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯、300 g/L葡萄糖酸，菌體含量15 g DCW/L，反應(yīng)體系為0.1 mol/L磷酸鉀緩沖溶液。

1.3 混凝劑使用方法

選擇 AlCl3·6H2O、Al2(SO4)3·18H2O、FeCl3、Fe2(SO4)3·XH2O、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、聚合硫酸鋁（PAS）、聚合硫酸鐵（PFS）等8種混凝劑作為考察對(duì)象，預(yù)先用去離子水配制300 g/L工作貯液，使用時(shí)按體積量取使用。

1.4 混凝實(shí)驗(yàn)步驟

參照文獻(xiàn)[6]方法。配制混凝劑溶液，將100 mL生物轉(zhuǎn)化液置于250 mL圓底燒瓶中，控制溫度20～30℃，pH值為初始值約7.0，同時(shí)300 rpm轉(zhuǎn)速攪拌。加入設(shè)定量混凝劑的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，保持快速攪拌1 min。降低攪拌速度至50 rpm促使絮體形成并保持絮體懸浮，低速攪拌15 min后停止攪拌，取樣，顯微鏡下觀察絮體形態(tài)。靜置30 min后減壓過濾記錄過濾速度，除去絮體后取樣檢測，計(jì)算蛋白去除率或者細(xì)胞去除率。

1.5 生物轉(zhuǎn)化液去乳化方法

將100 mL生物轉(zhuǎn)化液置于250 mL圓底燒瓶中緩慢機(jī)械攪拌（50 rpm），加入一定量的表面活性劑充分溶解，低速攪拌30 min后取樣，用顯微鏡觀察乳化現(xiàn)象。

1.6 分析方法

對(duì)于以細(xì)胞破碎液為催化劑的轉(zhuǎn)化液，各樣品進(jìn)行絮凝操作，過濾除絮體后取樣，根據(jù)Bradford法測定OD595值，計(jì)算蛋白質(zhì)含量[7]。根據(jù)公式（1）計(jì)算蛋白質(zhì)去除率：

其中，ΔCo為添加混凝劑前的蛋白質(zhì)濃度，g/L；ΔCI為添加混凝劑處理后的殘留蛋白質(zhì)濃度，g/L。

對(duì)于以靜息細(xì)胞為催化劑的轉(zhuǎn)化液，各樣品進(jìn)行絮凝操作后過濾除絮體后取樣分光光度計(jì)測定OD600值。根據(jù)公式（2）計(jì)算菌體細(xì)胞去除率：

其中，ΔAo為添加混凝劑前的轉(zhuǎn)化液OD600值；ΔAi為添加混凝劑處理后的轉(zhuǎn)化液OD600值。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物轉(zhuǎn)化液形貌分析

圖1 不同生物轉(zhuǎn)化液體系的顯微形態(tài)(10×20)：a，生物轉(zhuǎn)化液A；b，生物轉(zhuǎn)化液B。

實(shí)驗(yàn)選擇實(shí)驗(yàn)室制備的中低粘稠度的轉(zhuǎn)化液A與高粘稠度的轉(zhuǎn)化液B。如圖1所示，生物轉(zhuǎn)化液A體系較均勻，圖中顏色較深的為聚集在一起的菌體，而生物轉(zhuǎn)化液B存在大量不同尺寸的液滴，即發(fā)生了乳化現(xiàn)象，整個(gè)體系粘滯。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，向生物轉(zhuǎn)化液A中添加混凝劑鐵鹽、鋁鹽等作為混凝劑能有效聚結(jié)、沉淀轉(zhuǎn)化液中的菌體、蛋白質(zhì)等物質(zhì)；而對(duì)于已經(jīng)發(fā)生了乳化現(xiàn)象的生物轉(zhuǎn)化液B，乳化現(xiàn)象會(huì)影響混凝劑與蛋白質(zhì)、菌體的相互作用從而影響混凝效果，因此需要解決轉(zhuǎn)化液的乳化現(xiàn)象。

2.2 低粘度生物轉(zhuǎn)化液的菌體去除

鐵鹽、鋁鹽及其高聚物是研究的比較透徹的混凝劑并且廉價(jià)易得[8]，本試驗(yàn)我們考察了AlCl3·6H2O，Al2(SO4)3·18H2O，F(xiàn)eCl3，F(xiàn)e2(SO4)3·XH2O，MnCl2·4H2O，ZnSO4·7H2O，聚合硫酸鋁（PAS）和聚合硫酸鐵（PFS）等8種混凝劑對(duì)生物轉(zhuǎn)化液A中菌體蛋白混凝效果。在3.0～16.5 g/L濃度范圍內(nèi)，不同混凝劑的混凝效果示于圖 2。除MnCl2·4H2O，ZnSO4·7H2O外，其他6種混凝劑在一定濃度范圍內(nèi)的蛋白去除率可以達(dá)到接近100%(圖2)。這6種混凝劑的蛋白去除率隨著投藥量的增大而增大，但過高的混凝劑用量反而會(huì)降低蛋白質(zhì)的去除效率，尤其是AlCl3·6H2O，F(xiàn)eCl3這兩種混凝劑 (圖 2)。

對(duì)不同混凝劑混凝后的絮體進(jìn)行形貌觀察示于圖 3。MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O 處理得到的絮體細(xì)密，空隙極小，顯示該混凝過程中主要是電荷中和起的凝聚作用。而其它6種混凝劑則絮體疏松、空隙較大。這表明在絮體形成的過程中除了電荷中和、雙電層壓縮的作用外，水解產(chǎn)物的網(wǎng)捕卷掃對(duì)絮凝效果也起了重要的作用，導(dǎo)致混凝劑的使用量相對(duì)較少，混凝效果也相對(duì)較好[9]。

不同混凝劑處理對(duì)生物轉(zhuǎn)化液減壓抽濾時(shí)間的影響示于圖4。Al2(SO4)3·18H2O處理后的絮體最粘稠， 抽濾速度最慢；FeCl3，ZnSO4·7H2O 次之。圖5考察了不同菌體細(xì)胞濃度的生物轉(zhuǎn)化液混凝所需要的 Al2(SO4)3·18H2O 用量，在 4～24 g DCW/L菌體濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增大Al2(SO4)3·18H2O用量也相應(yīng)增大。

圖2 不同混凝劑不同濃度下的混凝效果

圖3 不同混凝劑混凝處理后的生物轉(zhuǎn)化液形貌(40×10)。其中，0，空白對(duì)照；1，AlCl3·6H2O；2，Al2(SO4)3·18H2O；3，F(xiàn)eCl3；4，F(xiàn)e2(SO4)3·XH2O；5，MnCl2·4H2O；6，ZnSO4·7H2O；7，PAS；8，PFS。

圖4 不同混凝劑對(duì)混凝處理后的生物轉(zhuǎn)化液的過濾時(shí)間的影響

圖5 不同菌體用量與硫酸鋁混凝劑用量的關(guān)系

2.3 生物轉(zhuǎn)化液破乳

考察了十二烷基磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、溴代十六烷基吡啶、十二烷基三甲基氯化銨和十六烷基三甲基氯化銨等5種表面活性劑的破乳效果。結(jié)果表明，十二烷基硫酸鈉具有較好的破乳效果，十二烷基磺酸鈉次之 (圖6)。圖中可以看到十二烷基硫酸鈉處理過的生物轉(zhuǎn)化液幾乎不存在乳化小液滴，十二烷基磺酸鈉處理過的樣品仍然含有部分小液滴，其他3種表面活性劑則不同程度的加劇了乳化現(xiàn)象。

向20 g/L表面活性劑處理過的生物轉(zhuǎn)化液B中添加乙酸乙酯萃取，十二烷基硫酸鈉處理的樣品不出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，十二烷基磺酸鈉處理的樣品仍然有部分乳化，其它3種表面活性劑對(duì)乳化現(xiàn)象沒有任何改善。

經(jīng)不同濃度的十二烷基硫酸鈉處理后，生物轉(zhuǎn)化液B中的乳化小液滴數(shù)量隨著十二烷基硫酸鈉的增加而減少，超過15 g/L十二烷基硫酸鈉處理能基本消除了乳化小液滴，直接乙酸乙酯萃取也不會(huì)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象（圖7）。因此，十二烷基硫酸鈉可以去除生物轉(zhuǎn)化液B的乳化現(xiàn)象，并且較高濃度處理后的生物轉(zhuǎn)化液直接進(jìn)行溶劑萃取亦不發(fā)生乳化現(xiàn)象。

圖6 不同表面活性劑處理后的生物轉(zhuǎn)化液形貌 (10×20)。其中，0，空白對(duì)照；1，十二烷基磺酸鈉；2，十二烷基硫酸鈉；3，溴代十六烷基吡啶；4，十二烷基三甲基氯化銨；5，十六烷基三甲基氯化銨。

圖7 不同濃度十二烷基硫酸鈉處理后的生物轉(zhuǎn)化液形貌(10×20)。其中，a，0 g/L；b，4.0 g/L；c，15.0 g/L；d，20.0 g/L。

2.4 發(fā)生乳化現(xiàn)象的高粘度生物轉(zhuǎn)化液菌體去除

乳化后的生物轉(zhuǎn)化液可以先表面活性劑處理使去乳化后，再混凝除去菌體及蛋白質(zhì)等物質(zhì)。表1考察了不同濃度十二烷基硫酸鈉處理后所需的混凝劑添加量，十二烷基硫酸鈉的最佳添加量為4.0 g/L，F(xiàn)eCl3用量9.0 g/L，其它混凝劑的添加量均可以為18.0 g/L。上述預(yù)處理工藝條件均能有效去除蛋白質(zhì)，去除率接近100%。

表1 發(fā)生乳化現(xiàn)象的生物轉(zhuǎn)化液經(jīng)不同濃度十二烷基硫酸鈉處理后所需的混凝劑用量

圖8 生物轉(zhuǎn)化液形貌變化。其中，a，未處理生物轉(zhuǎn)化液；b，4.0 g/L十二烷基硫酸鈉、18.0 g/L硫酸鐵處理過的生物轉(zhuǎn)化液；c，處理后的生物轉(zhuǎn)化液直接萃取效果。

圖8所示以硫酸鐵混凝劑為例，乳化后生物轉(zhuǎn)化液先采用4.0 g/L十二烷基硫酸鈉處理，然后18.0 g/L硫酸鐵混凝處理，可以明顯看到原本均勻分布的、穩(wěn)定的菌體蛋白質(zhì)、菌體碎片等物質(zhì)混凝成肉眼可見的易于去除的大顆粒 (圖8b)，處理后轉(zhuǎn)化液未過濾直接加入乙酸乙酯萃取也不會(huì)發(fā)生乳化現(xiàn)象 (圖8c)，且容易兩相分離，蛋白質(zhì)、菌體絮體懸浮在中間層。

3 結(jié)論

環(huán)境保護(hù)迫在眉睫，生物催化合成技術(shù)被越來越多地被工業(yè)采用。我們通過試驗(yàn)提出了簡單易行的生物轉(zhuǎn)化液后處理方法：未發(fā)生乳化的低粘度生物轉(zhuǎn)化液直接加入鋁鹽、鐵鹽或者其高聚物混凝處理；對(duì)于已經(jīng)發(fā)生乳化現(xiàn)象的高粘度生物轉(zhuǎn)化液，先添加少量表面活性劑十二烷基硫酸鈉處理后再混凝處理。處理后的生物轉(zhuǎn)化液幾乎檢測不到蛋白質(zhì)殘留，減少了后續(xù)分離操作中產(chǎn)物的損失，提高了生物過程的經(jīng)濟(jì)性。

[1]歐陽平凱，韋萍，姚忠.生物化工研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J].化工進(jìn)展，2003，22（1）：1-7.

[2]譚天偉.生物化工現(xiàn)狀與展望[J].化工中間體，2003（11）：6-10.

[3]Finkler L.,Luna-Finkler C.L.,Pinto J.C.,et al.Concentration of Cupriavidus necator cells by flocculation and sedimentation[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2007,23（12）:1789-1795.

[4]石亞靜，趙永強(qiáng)，王聰，等.絮凝劑在制藥發(fā)酵液預(yù)處理過程中的應(yīng)用研究[J].醫(yī)藥工程設(shè)計(jì)，2009，30（5）：13-15.

[5]曹政，王亞軍，肖黎，等.羰基還原酶不對(duì)稱還原(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的研究[J].生物加工過程，2013，11(1)：17-22.

[6]Whittington P.N.Fermentation broth clarification techniques[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,1990,23(2):91-121.

[7]Bradford M.M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of pro tein-dye binding[J].Analytical Biochemistry,1976,72（1-2）:248-254.

[8]袁宗宣，鄭懷禮，舒型武.絮凝科學(xué)與技術(shù)的進(jìn)展[J].重慶大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24（2）：143-147.

[9]葉健，吳純德，梁佳莉，等.硫酸鋁作為混凝劑時(shí)絮體破碎與再絮凝的研究[J].中國給水排水，2011，27（7）：71-74.