呂坤聚 石瑞雪 朱君祥

（中國人民解放軍第401醫(yī)院呼吸內(nèi)科 青島266000）

近年來，肺癌的發(fā)病率逐年增高，嚴重威脅人類健康，其中非小細胞肺癌占絕大多數(shù)，病理類型以肺鱗癌和腺癌最常見。肺癌的發(fā)生是多因素綜合作用的結果，涉及多基因的參與，CREB和CXCR2作為細胞內(nèi)信號轉導通路中兩個重要的信號分子，在肺癌組織中存在不同程度的異常表達，但目前尚未見二者在肺鱗癌和腺癌組織中相互關系的研究報道。本研究擬采用免疫組織化學Elivision法，檢測CREB和CXCR2在分化程度不同的肺鱗癌及腺癌組織中的表達，分析二者與肺癌分化程度的關系。

材料和方法

1.臨床資料

收集2010年1月－2011年1月中國人民解放軍第401醫(yī)院胸外科肺鱗癌和腺癌手術后石蠟標本49例：所有病例臨床資料完整，術前均未進行過化療和放療，所有病例均未合并肺癌以外的其他腫瘤，術后均經(jīng)我院有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生明確診斷。其中鱗癌22例，腺癌27例；高－中分化19例，低分化30例。另隨機選擇20例肺良性病變手術標本作為陰性對照，其中支氣管擴張7例，炎性假瘤9例，支氣管囊腫4例。所有標本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。

2.試劑

兔抗人CXCR2多克隆抗體（IgG型，編號bs－4836R）、兔抗人CREB多克隆抗體（IgG型，編號bs－0036R）均購于北京博奧森生物技術有限公司，顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

3.方法

采用免疫組織化學Elivision法。首先切片脫蠟至水，3%過氧化氫封閉10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復抗原，滴加一抗（CXCR2抗體稀釋比1∶100、CREB抗體稀釋比1∶200）4℃濕盒過夜，滴加二抗37℃孵育30 min，然后加DAB顯色，蘇木素對比染色，脫水、封片，顯微鏡下觀察。CXCR2和CREB陽性切片作陽性對照，同時PBS液取代一抗作陰性對照。

4.結果判斷

免疫組化染色以細胞中出現(xiàn)黃色顆粒為陽性，CREB陽性表達主要位于細胞核和胞漿中，CXCR2陽性表達主要位于胞膜和胞漿中，染色結果由病理科有經(jīng)驗的兩位專家評估。其結果評定標準參考文獻進行［1］：400倍光鏡下計數(shù)，每張切片隨機選擇10個高倍視野計數(shù)陽性細胞，以平均每100個細胞中含陽性細胞個數(shù)作為陽性細胞率：陽性細胞數(shù)＜10%為陰性（0分），陽性細胞數(shù)＜25%為弱陽性（1分），陽性細胞數(shù)25%－50%為陽性（2分），陽性細胞數(shù)＞50%為強陽性（3分）。根據(jù)染色強度依次計為陰性（0分）、弱陽性（1分）、陽性（2分）、強陽性（3分）。以陽性細胞率與染色強度之和作為免疫組化染色的評分：0分為陰性（－），1－2分為弱陽性（＋），3－4分為陽性（＋＋）5－6分為強陽性（＋＋＋）。在分析時將（－）和（＋）定義為CREB蛋白和CXCR2蛋白低表達，（＋＋）（＋＋＋）定義為高表達。

5.統(tǒng)計學處理

采用SAS8.1統(tǒng)計軟件進行等級資料非參數(shù)檢驗，H檢驗進行三組樣本比較，并進行三組間的兩兩比較，CXCR2和CREB表達陽性率的相關性分析采用Spearman等級相關分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.CREB在低分化、高－中分化肺癌組織和肺良性病變組織中的表達

CREB陽性表達于胞漿和胞核中，且以胞核為主，三組標本中CREB表達存在顯著差異（P＜0.01）（表1）。CREB表達在低分化肺癌組織和高－中分化肺癌組織之間的χ2值為10.074，P值為0.001；在高－中分化肺癌組織和肺良性病變組織之間的χ2值為0.8257，P值為0.1436；在低分化肺癌組織和肺良性病變組織之間的χ2值為18.750，P值為0.000。結果表明低分化肺癌組織和肺良性病變組織之間的差異最為顯著。病理染色結果（圖1－3）。

表1 CREB在低分化、高－中分化肺癌組織和肺良性病變組織中的表達Table 1 The expression of CREB inpoorly differentiated，well－moderately differentiated lung cancer tissue and lung benign lesions tissue

圖1 肺良性病變CREB陰性表達（×400）圖2 高－中分化肺腺癌CREB陽性表達，細胞漿和細胞核見大量黃色顆粒沉積（×400）圖3 低分化肺鱗癌CREB陽性表達，細胞漿和細胞核中見大量黃色顆粒沉積（×400）圖4 肺良性病變CXCR2陰性表達（×400）圖5 高－中分化肺腺癌組織CXCR2陽性表達，胞漿中見黃色顆粒沉積（×400）圖6 低分化肺鱗癌組織中CXCR2陽性表達，細胞漿見大量黃色顆粒沉積（×400）Fig.1 CREB negative expression in lung benign lesions.Fig.2 CREB positive expression in well－moderatelydifferentiated lung adenocarcinoma.The yellow particles were located in cell cytoplasm and nuclei.Fig.3 CREB positive expression in poorlydifferentiated lung squamous cell carcinoma.The brown particles were located mainly in cell nuclei and cytoplasm.Fig.4 CXCR2 negative expression in lung benign lesions.Fig.5 CXCR2 positive expression in well－moderatelydifferentiated lung adenocarcinoma tissue.The yellow particles were located mainly in cell cytoplasm.Fig.6 CXCR2 strong positive expression in poorlydifferentiated lung squamous cell carcinoma tissue.The brown particles were located mainly in cell cytoplasm.

2.CXCR2在低分化、高－中分化肺癌組織和肺良性病變組織中的表達

CXCR2陽性表達主要位于細胞漿和細胞膜，三組樣本中CXCR2的表達具有顯著差異（P＜0.01）（表2）。CXCR2表達在低分化肺癌組織和高－中分化肺癌組織之間的χ2值為4.102，P值為0.035；CXCR2在高－中分化肺癌組織和肺良性病變組織之間的χ2值為4.631，P值為0.013；在低分化肺癌組織和肺良性病變組織之間的χ2值為17.878，P值為0.000。各組之間的P值均＜0.01，說明各組之間的差異均有統(tǒng)計學意義，同時低分化肺癌組織和肺良性病變組織之間的差異最為顯著。病理染色結果（圖4－6）。

表2 CXCR2在低分化、高－中分化肺癌組織和肺良性病變組織中的表達Table 2 The expression of CXCR2 in poorly differentiated，well－moderately differentiated lung cancer tissue and lung benign lesions tissue

3.肺癌組織中CREB與CXCR2表達的相關性在肺鱗癌及腺癌組織中，運用秩相關分析檢驗得出r＝0.3186（P＜0.05），說明肺鱗癌及腺癌組織中CREB和CXCR2的表達呈正相關關系（表3）。

表3 肺癌組織中CREB與CXCR2表達的相關性Table 3 The correlation ofCREB and CXCR2 in lung cancer tissue

討 論

CREB是細胞內(nèi)重要的轉錄調(diào)節(jié)因子，由341個氨基酸殘基構成，分子量為43 KDa，屬于轉錄因子亮氨酸拉鏈家族CREB／ATF亞群，CREB發(fā)生磷酸化而活化后，形成同源或異源二聚體，在輔助因子的幫助下，識別并結合目的基因啟動子中的c AMP反應元件（c AMP response element，CRE），促進該基因的轉錄表達，參與腫瘤的增殖、分化和轉移［2］。劉偉等通過研究肺癌組織和肺良性腫瘤組織中CREB和磷酸化CREB蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)二者在肺癌組織中的表達水平較高［3］。國外已有研究有表明，胞外信號激酶、核糖體S6激酶、CREB和Bc L－2在H1734非小細胞肺癌細胞株中表達明顯增高，當用CREB特異性阻斷劑Ro－31－8220處理該細胞株后，核糖體S6激酶、胞外信號激酶和CREB的活性都受到明顯抑制，使細胞周期處于有絲分裂期，同時抗凋亡蛋白Bc L－2表達水平降低，從而誘導肺癌細胞的凋亡［4］。由此認為CREB過度表達可能與肺癌的發(fā)生有關。

CXCR2為7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，多表達于腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞的表面，是細胞內(nèi)促血管生成趨化因子的共同受體，CXCR2與其配體結合后，可引起血管內(nèi)皮細胞增殖、趨化運動及抑制內(nèi)皮細胞凋亡，促進血管新生［5］。已有文獻報道，在小鼠肺癌模型中，CXCR2可促進腫瘤相關血管生成和肺癌的早期發(fā)展，CXCR2（＋／＋）模型與CXCR2（－／－）模型相比，腫瘤相關的新血管生成及腫瘤的發(fā)展和轉移明顯升高［6］。由此認為，CXCR2的過度表達可能在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。

本研究結果顯示，CREB和CXCR2在肺良性病變組織胞漿和胞核中陰性表達，而在肺鱗癌和腺癌組織中高表達。CXCR2隨著肺癌組織分化程度的降低，表達水平明顯升高，各組之間均有顯著差異，且以低分化肺癌組和肺良性病變組之間的差異最為顯著。CREB的表達在低分化肺癌組和高－中分化肺癌組之間以及低分化肺癌組和肺良性病變組之間的差異均有顯著性。本實驗表明CREB和CXCR2的表達水平與肺癌的分化程度有關，腫瘤分化程度越低，CREB和CXCR2的表達就越高，提示CREB和CXCR2在肺癌組織中表達水平越高，肺癌的惡性程度就越高，充分說明了CREB和CXCR2的異常活化在肺癌組織的分化中起著不可忽視的作用。另外，本實驗的研究還發(fā)現(xiàn)CREB在胞核和胞漿中均有表達，且分化程度或惡性程度越高，胞核中的表達就越強，這可能提示在肺鱗癌和腺癌發(fā)生和發(fā)展的過程中，胞漿中的CREB發(fā)生磷酸化從而移位到胞核中，發(fā)揮其轉錄調(diào)節(jié)因子的作用，這有待于進一步的實驗探索。

本研究結果表明CREB和CXCR2在不同分化程度的肺鱗癌和腺癌組織中均高表達，且CREB和CXCR2的表達水平呈正相關關系。國外已有研究報道，當采用CREB蛋白特異性阻斷劑抑制A549肺癌細胞株中CREB蛋白的表達后，CXC趨化因子在細胞中的基因表達水平顯著下降［7］，這表明CREB和CXCR2在肺癌發(fā)生演進中可能存在一定的調(diào)控關系，但具體的調(diào)控機制還有待于進一步的實驗研究。

總之，CREB和CXCR2在肺鱗癌和腺癌組織中高表達，且腫瘤分化程度越低，二者的蛋白表達水平越高。我們推測CREB和CXCR2可能共同參與了肺癌的發(fā)展和演變，為肺癌的靶向治療提供了新的理論證據(jù)，而更深層次的分子生物學機制還有待進一步的探索。

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