尚旭嵐，方升佐，徐錫增

(南京林業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，江蘇 南京 210037)

綜合處理措施對解除青錢柳種子休眠的影響

尚旭嵐，方升佐，徐錫增

(南京林業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，江蘇 南京 210037)

研究了綜合處理措施對青錢柳種殼結(jié)構(gòu)和透性的影響，并對休眠解除過程的果皮浸提液進行了生物測定。結(jié)果表明：濃硫酸處理可在一定程度上破壞青錢柳種子木質(zhì)堅硬的種殼結(jié)構(gòu)；在酸蝕處理基礎上再進行GA3浸泡和GA3拌沙層積處理，隨著層積時間的延長，種殼表面出現(xiàn)孔洞且逐漸變大，種胚含水量和種子呼吸速率顯著提高，果皮浸提液抑制作用顯著降低，裂口萌動種子中可能具抑制作用的物質(zhì)種類減少。說明綜合層積處理能有效破壞青錢柳種子堅硬的種殼結(jié)構(gòu)，改善種皮透性，促進果皮中抑制物質(zhì)的降解，從而加速種子休眠的解除。

青錢柳；酸蝕處理；拌沙層積處理；種殼結(jié)構(gòu)；透性；抑制物質(zhì)

青錢柳Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinskaja，又名青錢李、搖錢樹等，系胡桃科Juglandaceae青錢柳屬植物，是我國特有的單種屬植物。青錢柳廣泛分布于江西、浙江、江蘇、安徽、福建、湖北、湖南、四川和貴州等地海拔420～2 500 m的山區(qū)、溪谷或石灰?guī)r山地[1]。青錢柳集藥用、材用和觀賞等多種價值于一身，是一種具有極高保護和開發(fā)利用價值的珍貴樹種[1-2]。青錢柳種子具深休眠習性，在一般播種育苗條件下隔年才能萌發(fā)，嚴重影響了其產(chǎn)業(yè)化進程。目前對其休眠原因已有了較深入的研究[3-6]，也有學者對解除其休眠的措施進行了探索，結(jié)果表明酸蝕后再進行GA3浸泡和GA3拌沙層積的綜合處理措施能有效解除青錢柳種子的休眠[7-8]，但對其作用機理還不完全清楚。本文中通過研究酸蝕后GA3浸泡和GA3拌沙層積的綜合處理措施對青錢柳種皮結(jié)構(gòu)和透性的影響，并對解除休眠的種子果皮浸提液進行了生物測定和GC-MS鑒定，旨在探討青錢柳種子休眠解除的機制并為生產(chǎn)上采取相應的技術(shù)措施提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試驗設計

供試種子采自云南昆明植物園（25°10′N，102°44′E，海拔1 943 m）單株青錢柳（樹高，14 m；胸徑，26 cm），種子千粒重為85.25 g，飽滿率為41%。

酸蝕處理：種子去翅后用98%濃硫酸進行酸蝕處理，浸泡2.5 、5.0 和7.5 h后搓去碳化層，用流水沖洗干凈，陰干待用。以未經(jīng)處理的完整干種子作為對照（干CK）。

層積處理：分自然層積處理和綜合層積處理兩種方案。自然層積處理是將青錢柳干種子清水浸種48 h后，清水拌沙后置于室外層積，種沙比約為1︰3。分別在層積1個月、2個月、3個月和4個月定時取樣進行指標測定，以未經(jīng)處理的完整干種子作為對照（記為0）。綜合層積處理是將種子進行酸蝕5.5 h后用500 mg·kg-1GA3浸種48 h，再用400 mg·kg-1GA3拌沙，按種沙比1︰3混勻后置于室外層積。取樣時間設置為層積2個月（記為層2月）、層積3個月（記為層3月）、種子萌動裂口（記為裂口）、胚根剛伸出種皮（記為胚根伸出）。以未經(jīng)處理的完整干種子作為對照（干CK）。

1.2 測定方法

1.2.1 不同酸蝕時間種殼結(jié)構(gòu)的觀察

取2.5、5和7.5 h 3個酸蝕處理時間和干CK種子，在掃描電子顯微鏡下觀察種子表面結(jié)構(gòu)并進行記錄和拍照。過程如下：取各處理種子10顆，在乙二胺中恒溫浸泡24 h，軟化種皮，使種子容易解剖，然后將種子置于4%戊二醛中固定，0.1 M PBS清洗，乙醇系列脫水（30%、50%、70%、90%、100%），轉(zhuǎn)入乙酸異戊酯置換，CPD-2臨界點干燥儀干燥、粘臺、離子濺射儀噴金，PHILIPS SEM-505掃描電子顯微鏡觀察下觀察、拍照。

1.2.2 綜合層積處理過程種殼結(jié)構(gòu)的觀察

取綜合層積處理30 、45 和60 d的種子各10顆，在掃描電子顯微鏡下觀察種子表面結(jié)構(gòu)并進行記錄和拍照，其方法同1.2.1。

1.2.3 種胚含水量和種子呼吸速率的測定

按試驗設計在自然層積和綜合層積各階段取樣進行種胚含水量和種子呼吸速率的測定。呼吸速率測定采用小籃子法[9]。每個處理各取種子100粒，3次重復。含水量測定采用高溫烘干法，取樣后分離出種胚，在130℃恒溫條件下，烘至恒質(zhì)量。

式中：C為含水量（%）；M1為樣品盒和蓋的質(zhì)量(g)；M2為樣品盒和蓋及樣品的烘前質(zhì)量(g)；M3為樣品盒和蓋及樣品的烘后質(zhì)量（g）。

1.2.4 層積過程中果皮甲醇浸提液的生物測定和萌動種子浸提液GC-MS鑒定

取綜合層積處理不同時段的果皮干粉末10 g置于100 mL錐形瓶中，加入 4倍體積80%甲醇，混勻后放入冰箱，在1～4 ℃的條件下密閉浸提。其間多次取出搖動使其充分浸提，24 h后過濾，重復浸提2次后，混合3次所得的浸提液，減壓濃縮后定容到1 g·mL-1。參考尚旭嵐等[5]的方法對各取樣時段的果皮浸提濃縮液稀釋至0.2 g·mL-1進行白菜種子生物測定。另將裂口種子1 g·mL-1果皮浸提液送中國林科院林產(chǎn)化工研究所儀器分析室，參考尚旭嵐等[5]的條件進行GC-MS鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0進行單因素方差分析，并用Duncan法檢驗其差異顯著性。結(jié)果以平均數(shù)±標準偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酸蝕時間對種殼結(jié)構(gòu)的影響

青錢柳種子經(jīng)酸蝕處理后，不僅種子變小，種殼變薄，而且其種殼表面出現(xiàn)了很多變化。不同酸蝕時間處理后種殼結(jié)構(gòu)的電鏡觀察結(jié)果顯示，未經(jīng)處理的青錢柳種子種殼表面角質(zhì)化（見圖1A）；濃硫酸處理2.5 h后搓表面變得坑坑凹凹，出現(xiàn)少量腐蝕坑(見圖1B)；酸蝕5 h和7.5 h后種殼表面的腐蝕坑越來越多，且越來越大（見圖1C和1D）。

2.2 綜合層積處理對種殼結(jié)構(gòu)的影響

與干種子角質(zhì)化表皮結(jié)構(gòu)（見圖2A）相比，綜合層積處理30 d時種殼表面出現(xiàn)了小洞（見圖2B），而且這些孔洞隨層積時間的延長而變大（見圖2C和圖2D），這種特殊的結(jié)構(gòu)變化有利于種子吸水和透氣，從而加速種子休眠的解除。

2.3 不同層積處理對種子透性的影響

2.3.1 不同層積處理過程種胚含水量變化

水分是控制種子萌發(fā)的最重要因素，只有在細胞內(nèi)自由水增多的條件下，種子的貯藏物質(zhì)才能被動員，同時使酶活化或合成而起催化作用。

圖1 不同酸蝕時間處理后種殼結(jié)構(gòu)變化Fig. 1 Changes of ultra-structure of husk scarif i ed in sulphuric acid for different times

圖2 綜合處理措施層積過程種殼結(jié)構(gòu)變化Fig. 2 Changes of husk treated by comprehensive treatments during stratif i cation

從圖3可看出，隨著層積時間的延長，綜合層積處理的種胚含水量呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，干種子種胚的含水量為4.97%，層積至剛裂口時含水量達到35.01%，比干種子增加了6倍。方差分析和多重比較結(jié)果表明，層積處理各階段種胚的含水量差異達到極顯著水平。對于自然層積種子來說，層積第1個月種胚含水量有一個較大的提高，但隨著層積時間的延長其種胚的含水量變化不大，到層積4個月時含水量仍只有18.94%。多重比較結(jié)果也表明，層積4個月間的種胚含水量未達到極顯著差異水平。

圖3 不同層積處理過程種胚含水量變化Fig.3 Changes of water content in embryos under different treatments

2.3.2 不同層積處理過程種子呼吸速率變化

一般干燥種子的呼吸都被抑制在最低水平上，但隨著種子的吸脹，呼吸作用會不斷增強。通過對不同層積處理過程中呼吸速率的比較，來闡明青錢柳種子休眠解除過程的呼吸生理。

從圖4中可知，隨著綜合層積處理時間的延長，青錢柳種子的呼吸速率不斷提高，層積到第3個月時提高到28.1 mg·(100 g)-1，這說明綜合層積處理可在一定程度上改善種皮的透氣情況，至種子裂口萌動時，其呼吸速率達到干種子的9.96倍，到胚根伸出時進一步增加到干種子的15.21倍，達到94.17 mg·(100g)-1。方差分析和多重比較結(jié)果表明，綜合層積處理各階段的種胚呼吸速率差異達到極顯著水平。隨著自然層積時間的延長，青錢柳種子的呼吸速率有所提高，但整個層積過程的呼吸速率變化都較小。方差分析和多重比較結(jié)果也表明，自然層積4個月時的呼吸速率才與干種子達到極顯著差異水平。說明自然層積過程種子內(nèi)部的代謝活動很微弱，這可能就是青錢柳種子在自然條件下通常需要兩冬一夏才能萌發(fā)的原因之一。

圖4 不同層積處理種子呼吸速率變化Fig. 4 Changes of respiratory rate in seeds under different treatments

2.4 果皮甲醇浸提液對白菜苗高和根長的影響

綜合層積處理種子休眠解除過程的種子果皮甲醇浸提液生物測定結(jié)果（見圖5）表明，從干種子至裂口萌發(fā)，白菜種子的苗高和根長逐漸增加，說明果皮浸提液對白菜種子的抑制作用隨著層積時間的延長逐漸降低。方差分析結(jié)果表明，不同層積時間果皮浸提液對苗高和根長的差異均達到極顯著水平（苗高F=41.500，P＜0.01；根長F=48.683，P＜0.01）。多重比較結(jié)果顯示，干種子和水浸12 d的苗高和根長與對照及其它層積時間之間均有極顯著差異，說明干種子的抑制作用最強，而果皮中的抑制物質(zhì)可能隨休眠的解除而不斷降解，因此到種子裂口萌動時抑制作用最弱。

圖5 休眠解除過程中果皮甲醇浸提液對白菜生長的影響Fig.5 Effects of extracts from pericarp during breaking dormancy on cabbage growth

2.5 裂口萌動種子果皮甲醇浸提液GC-MS鑒定

將已裂口萌動種子的果皮甲醇浸提液進行GC-MS鑒定，其總離子流程見圖6。具有發(fā)芽抑制作用的有機化合物的種類及相對含量列于表1。

裂口萌動種子果皮甲醇浸提液中可能具抑制作用的有機化合物的種類和含量較干種子果皮明顯減少[5]，而且未發(fā)現(xiàn)抑制作用較強的酚酸類化合物及其衍生物，這可能正是萌動種子果皮浸提液抑制作用降低的原因。

圖6 萌動種子果皮甲醇浸提液GC-MS總離子流色譜Fig. 6 Total ion chromatogram of methanol extract from pericarp of germinating seeds

表1 萌動種子果皮甲醇浸提液的GC-MS分析結(jié)果Table 1 Results of GC-MS analysis for methanol extract from pericarp of germinating seeds

3 討 論

解除種子休眠的方法很多[10-13]，如化學藥劑處理、激素處理、層積及一些物理方法，通常需要針對種子休眠的原因來尋找適宜的破眠方法。許多林木種子休眠的原因并不是單一的，因此需要采用綜合的處理措施來解除其休眠。如深休眠的秤錘樹種子在酸蝕2 d的基礎上經(jīng)500 mg·kg-1GA3溶液浸種預處理可獲得40.1%的出苗率[14]。對大果冬青種子采用濃硫酸處理1.5 h后經(jīng)250 mg·kg-1GA3和0.2 % KNO3混合溶液浸種24 h，再進行冷變溫層積的綜合處理措施可提高其發(fā)芽率[16]。王艷華等[12]研究表明，采用濃硫酸處理40 min+400 mg·kg-1GA3浸種+3～5℃低溫層積30 d的綜合處理措施可快速打破大山櫻種子的休眠。前期研究結(jié)果表明，青錢柳種子經(jīng)酸蝕后再進行GA3浸種和GA3拌沙室外變溫層積能有效解除青錢柳種子休眠[8]，但此綜合處理措施的破眠機制尚不明晰。

董厚德等[17]對結(jié)縷草種子休眠解除前后的種皮結(jié)構(gòu)進行掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理的種子脂類物質(zhì)及穎孔蓋脫落，穎孔被打開，構(gòu)成穎的纖維網(wǎng)絡清晰可見，因此種子內(nèi)外的水、氣交換可順利進行，減少胚生長的阻力，發(fā)芽率達到潛在生活力水平。Lin等[18]研究結(jié)果表明，熱水浸泡等處理可促進苦瓜種子萌發(fā)和幼苗生長，通過對其種皮表面結(jié)構(gòu)電鏡掃描觀察，發(fā)現(xiàn)采用熱水浸泡等處理可使種皮細胞更大，細胞間隙也變大，透水透氣性得改善，這是種子休眠解除的原因之一。黃丹等[19]對美國桂花種子的研究結(jié)果也表明，隨著低溫濕沙層積時間的增加，美國桂花種殼中的種孔直徑有明顯增大、數(shù)量不斷增多的趨勢。陳昕等[20]對層積處理過程中黃山花楸種子表皮和子葉細胞進行了透射電鏡觀察，結(jié)果表明黃山花楸種子萌發(fā)率和休眠解除效果與種皮角質(zhì)層破裂解體、子葉細胞結(jié)構(gòu)變化及儲藏物質(zhì)降解程度密切相關(guān)。本研究通過電鏡掃描觀察，結(jié)果表明酸蝕處理不僅可以有效破壞青錢柳種子表面的角質(zhì)層，而且適當?shù)母g還可使種皮明顯變薄，這樣不僅可增加種皮的透性，又可減輕胚根突破種皮時的機械阻力。在酸蝕處理基礎上再進行GA3浸種和GA3拌沙的綜合層積處理，種皮表面出現(xiàn)了明顯的小孔洞，而且這些孔洞隨層積時間的延長而變大。從青錢柳種子層積各階段種胚含水量和種子呼吸速率測定結(jié)果來看，自然層積處理的變化較小，而綜合層積處理的種子隨層積時間的延長至種子萌動均達到極顯著差異水平，這與其種殼表面結(jié)構(gòu)的變化是基本一致的，表明綜合層積處理措施有效促進了種皮透性的改善。

Wróbel等[21]研究表明，休眠的葡萄種子中含有較高含量的兒茶酸和沒食子酸，以及少量的香豆酸等酚酸類物質(zhì)，層積后這些物質(zhì)含量都大大降低。Soltani等[22]對東方山毛櫸種子進行研究后發(fā)現(xiàn)，休眠解除過程酚類物質(zhì)含量也呈現(xiàn)不斷降低的趨勢。本實驗結(jié)果表明，青錢柳果皮浸提液的抑制作用隨休眠的解除而不斷減弱，與未經(jīng)處理的種子相比[5]，裂口萌動種子果皮甲醇浸提液中可能具發(fā)芽抑制作用的有機化合物的種類減少，這說明綜合層積處理措施有效促進了青錢柳種子中香草酸等酚類物質(zhì)的降解，從而使種子休眠較快得以解除。

綜上所述，酸蝕處理可在一定程度上破壞青錢柳種子木質(zhì)堅硬的種皮結(jié)構(gòu)，減輕其機械障礙和透性障礙。在此基礎上進行GA3浸種和拌沙綜合層積處理，能夠促進種皮透性的改善和果皮中抑制物質(zhì)的降解，從而加速種子休眠的解除。因此，在生產(chǎn)上采用酸蝕處理結(jié)合GA3浸種和GA3拌沙的綜合層積處理措施是快速有效的，但值得注意的是，在進行酸蝕處理時，應根據(jù)種子千粒重大小以及種皮厚度確定最佳的酸蝕時間，否則容易出現(xiàn)因酸蝕時間不當導致種子難萌發(fā)或種胚受傷的情況。

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Effects of comprehensive treatments on breaking dormancy of Cyclocarya paliurus seeds

SHANG Xu-lan, FANG Sheng-zuo, XU Xi-zeng
(College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China)

Cyclocarya paliurusseeds remain deep dormancy characteristics, and the seeds usually take two years to germinate in natural condition. The effects of comprehensive treatments to the structure and permeability of husk were studied, and the bioassays of the pericarp extract during breaking dormancy were measured. The results show that the chemical scarif i cation with concentrated sulphuric acid (H2SO4) could destroy the hard structure of husk to a certain extent, therefore could alleviate the mechanical and permeability barriers; after chemical scarif i cation, the seeds were soaked in gibberellic acid (GA3) and then stratif i ed in the sand moistened with GA3;while the stratif i cation time of comprehensive treatments was prolonged, some pores appeared in the surface of husk and gradually became larger; meanwhile, the water content on embryo and seed respiratory were signif i cantly enhanced, however the inhibitory effects of pericarp extract were signif i cantly reduced. The Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) identif i cation results for methanol extract from pericarp showed that there were fewer potential inhibitors in the germinating seeds than those in the untreated seeds. In conclusion, the comprehensive treatments combined with chemical scarif i cation, exogenous application of GA3and stratif i cation could destroy the hard structure of husk, promote the exchange of gas and water, and accelerate the degradation of inhibitors, therefore it could alleviate dormancy ofC. parliurusseeds in a relatively short period of time.

Cyclocarya paliurus; acid etching; mixing sand stratif i cation; seed husk structure; permeability; inhibitory substance

S718.43；Q945.35

A

1673-923X(2014)01-0042-07

2013-08-10

國家林業(yè)局林業(yè)科學技術(shù)推廣項目﹙［2011］18 號)；國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（編號：200904046）

尚旭嵐（1978-），女，四川樂山人，講師，主要從事森林培育研究；E-mail：shangxulan@njfu.edu.cn

方升佐（1963-），男，安徽歙縣人，教授，主要從事人工林定向培育研究；E-mail：fangsz@ njfu. edu. cn

[本文編校：謝榮秀]