曹 瑞 張 紅 師延瓊 鄭 蓓 崔春利 郭東艷

響應(yīng)面分析法(response surface methology，RSM)是一種篩選工藝比較好的方法，能篩選各個(gè)因素和因素與因素之間相互作用在工藝優(yōu)選中對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)即響應(yīng)值的影響，可以表達(dá)因素和評(píng)價(jià)指標(biāo)之間的關(guān)系［1］。和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同，可以通過(guò)軟件擬合二項(xiàng)式模型，然后求得偏導(dǎo)數(shù)，得出較優(yōu)參數(shù)，可以較好的反應(yīng)出實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果表達(dá)［2］。目前，生地黃的提取多采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化考察，本實(shí)驗(yàn)引入中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合效應(yīng)面法優(yōu)選生地黃的提取工藝，旨在優(yōu)化水提取工藝的同時(shí)，為探討中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)－響應(yīng)面法應(yīng)用于中藥提取工藝的可行性提供依據(jù)。

材料與方法

1．材料與儀器:生地黃(西安盛興中藥飲片有限責(zé)任公司，批號(hào):111101)，蒽酮(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20120701)，梓醇對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào):110808－200508)，葡萄糖對(duì)照品(20090201)，95%乙醇、濃硫酸均為分析純，甲醇、乙腈均為色譜純，水為重蒸餾水。GB204梅特勒電子天平(瑞士制造);UV1102紫外分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司);日立L－2400型高效液相色譜儀(L－2130雙泵，L－2400檢測(cè)器，EZStart工作站);恒溫水浴鍋(HH－2型，北京科偉永興儀器有限公司)。

2．樣品中多糖與梓醇的含量測(cè)定:(1)多糖的含量測(cè)定:①對(duì)照品溶液的制備:精密稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖，加蒸餾水配制成每1ml含0．054mg的溶液，即得;②供試品溶液的制備:精密移取提取液0．5ml至100ml量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度，即得;③顯色條件:加入新鮮配制的0．2%蒽酮試劑4ml，沸水浴15min，取出立即置冰水浴冷卻20min，即得。(2)梓醇的含量測(cè)定:①色譜條件:色譜柱:Thermo－C18柱(250mm ×4．6mm，5μm)流動(dòng)相:乙腈 －0．1% 磷酸水(1∶99)，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，柱溫30℃，流速1ml/min;②對(duì)照品溶液的制備:精密稱取對(duì)照品適量，加流動(dòng)相制成每1ml含0.154mg的溶液，即得;③供試品溶液的制備:精密移取提取液1ml，加蒸餾水定容至100ml量瓶中，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

3．單因素試驗(yàn)考察:(1)提取時(shí)間考察:分別稱取生地黃飲片50g，加10倍量水，煎煮2次，煎煮時(shí)間分別為30、60、90、120、150min，過(guò)濾，合并濾液，濃縮至 100ml量瓶中。(2)加水倍量考察:分別稱取生地黃飲片50g，煎煮時(shí)間為90min，煎煮2 次，加水倍量分別為8、10、12、14、16 倍，過(guò)濾，并將所得濾液濃縮至100ml量瓶中。(3)提取次數(shù)考察:分別稱取生地黃飲片50g，煎煮時(shí)間為90min，加水量10倍，煎煮次數(shù)分別為1、2、3、4次，過(guò)濾，并將所得濾液濃縮至100ml量瓶中。

4．中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)選水提工藝條件:在煎煮時(shí)間、加水倍量、煎煮次數(shù)3個(gè)影響生地黃多糖和梓醇含量的單因素基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法將這3個(gè)影響因素作為自變量，將生地黃多糖及梓醇綜合加權(quán)含量進(jìn)作為響應(yīng)結(jié)果進(jìn)行設(shè)計(jì)。綜合評(píng)分=0．4W1/Wmax1+0．6W2/Wmax2，W1為多糖含量，Wmax1為多糖含量最大值，W2為梓醇含量，Wmax2為梓醇含量最大值。

5．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用Design Expert統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)資料用方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．多糖含量測(cè)定線性范圍:(1)檢測(cè)波長(zhǎng)的確定:取對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)系列中含量為0．0486mg的葡萄糖對(duì)照品溶液。以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，以200～800nm波長(zhǎng)掃描，測(cè)定葡萄糖的最大吸收。結(jié)果葡萄糖在625nm波長(zhǎng)處有最大吸收值。(2)線性關(guān)系考察:分別量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0．3、0．6、0．9、1．2、1．5、1．8ml置具塞試管中，加水至 2．0ml，加入新鮮配制的0．2%蒽酮試劑4ml，沸水浴15min，取出立即置冰水浴冷卻20min，以相應(yīng)試劑為空白，在625nm測(cè)定吸光度，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程為:Y=5．0988X+0．1334(R2=0．9995)。結(jié)果表明，在0．0162 ～0．0972mg的范圍內(nèi)線性良好。

2．梓醇含量測(cè)定線性范圍:精密吸取梓醇對(duì)照品溶液 3、6、9、12、15、18μl，依“梓醇的含量測(cè)定”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以梓醇的含量為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程為:Y=150045X+35910(R2=0．9997)，結(jié)果表明，在 0．462 ～2.772μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3．單因素實(shí)驗(yàn):(1)提取時(shí)間的考察:按照本文中“多糖的含量測(cè)定”項(xiàng)下方法及“梓醇的含量測(cè)定”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，并依據(jù)上述顯色條件及色譜條件，測(cè)定多糖及梓醇的含量。進(jìn)行綜合評(píng)分(即多糖含量權(quán)重系數(shù)為0．4，梓醇含量權(quán)重系數(shù)為0．6)。結(jié)果表明:加10倍量水，煎煮2次，每次煎煮90min時(shí)多糖及梓醇含量最高。結(jié)果見表1。(2)加水倍量考察:按照本文中“多糖的含量測(cè)定”項(xiàng)下方法及“梓醇的含量測(cè)定”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，并依據(jù)上述顯色條件及色譜條件，測(cè)定多糖及梓醇的含量。結(jié)果表明，煎煮2次，每次煎煮90min時(shí)，加10倍量水，多糖及梓醇含量最高。結(jié)果見表2。(3)提取次數(shù)考察:按照本文中“多糖的含量測(cè)定”項(xiàng)下方法及“梓醇的含量測(cè)定”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，并依據(jù)上述顯色條件及色譜條件，測(cè)定多糖及梓醇的含量。結(jié)果表明:加10倍量水煎煮90min，煎煮2次時(shí)多糖及梓醇含量最高。結(jié)果見表3。

表1 提取時(shí)間考察結(jié)果

表2 加水倍量考察結(jié)果

表3 提取次數(shù)考察結(jié)果

4．中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)選水提工藝條件:(1)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平表見表4，響應(yīng)面試驗(yàn)方案及中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。采用Design Expert軟件對(duì)所得的提取回歸模型方差分析結(jié)果見表6?；貧w方程中各個(gè)變量因素對(duì)加權(quán)含量響應(yīng)值的顯著性用F值來(lái)檢驗(yàn)，F(xiàn)的值越小，相應(yīng)的變量顯著程度越高。從表7中可以看出，方程中X2(加水倍量)、X3(煎煮次數(shù))、X1X2、(煎煮時(shí)間和加水倍量交互)(煎煮時(shí)間的二次方)、(加水倍量的二次方)、(煎煮次數(shù)的二次方)影響都比較顯著，X1、(煎煮時(shí)間)X1X3、(煎煮時(shí)間和煎煮次數(shù)交互)X2X3(加水倍量和煎煮次數(shù)交互)沒(méi)有顯著性影響。在3個(gè)因素中，煎煮次數(shù)和加水倍量對(duì)生地黃多糖和梓醇的加權(quán)含量影響比煎煮時(shí)間對(duì)其的影響要大。此模型的P＜0．0001，說(shuō)明回歸模型達(dá)到高度顯著水平。失擬誤差P=0.585，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明該模型對(duì)試驗(yàn)擬合情況較好，試驗(yàn)存在誤差較小，可以用此模型對(duì)水煎煮生地黃多糖及梓醇含量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由Box－Behnken試驗(yàn)擬合出的多糖及梓醇加權(quán)含量Y對(duì)提取時(shí)間X1、加水倍量X2、提取次數(shù)X3的二次多項(xiàng)回歸方程為:Y=0．91 －1．521E －003X1+8．649E －003X2+0．017X3+0．010X1X2+4．247E －003X2X3+(2)響應(yīng)面優(yōu)化與分析:根據(jù)二次多項(xiàng)式方程，分別繪制指標(biāo)與響應(yīng)顯著的交互項(xiàng)的響應(yīng)曲面圖和等高線圖，比較圖1～圖3中響應(yīng)曲面圖可知，煎煮時(shí)間和加水倍量的交互作用對(duì)生地黃多糖及梓醇含量的提取率為最顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)面曲面，故煎煮時(shí)間和加水倍量的調(diào)整對(duì)生地黃多糖及梓醇含量的影響較大。煎煮次數(shù)與其他兩因素的交互作用不及煎煮時(shí)間和加水倍量的交互作用明顯。由Design Expert軟件給出了最佳條件為:提取時(shí)間為117．53min，加水倍量為13．75倍，提取次數(shù)為2次，預(yù)測(cè)的最佳提取率加權(quán)評(píng)分為0．81。但是根據(jù)實(shí)際情況及可操作性，調(diào)整的最佳提取工藝條件為提取時(shí)間120min，加水倍量14倍，提取次數(shù)2次。

表4 因素與水平

表5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表6 回歸方程方差分析

圖1 煎煮時(shí)間和加水倍量對(duì)加權(quán)含量的影響

5．驗(yàn)證試驗(yàn):按修正過(guò)的最佳條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的綜合評(píng)分分別為0．79、0．80、0.82，平均值為0．80。與預(yù)測(cè)值基本一致，可見響應(yīng)模型可以較好的反映出生地黃多糖及梓醇的提取的條件。

討 論

本實(shí)驗(yàn)以生地黃中主要成分梓醇及多糖含量的綜合評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)－響應(yīng)面法優(yōu)選最佳水提取工藝研究。確定了最優(yōu)的水提取條件為:加14倍倍量水，提取2次，每次120min。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定可行。

圖2 加水倍量和煎煮次數(shù)對(duì)加權(quán)含量的影響

圖3 煎煮時(shí)間和煎煮次數(shù)對(duì)加權(quán)含量的影響

生地黃中主要含有多糖和環(huán)烯醚萜苷類成分，提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)也多為多糖和梓醇的含量。多糖及環(huán)烯醚萜苷類都為極性比較大的成分，且水溶性較強(qiáng)，根據(jù)相似相溶原理及相關(guān)些文獻(xiàn)報(bào)道，最終選擇水作為提取溶媒，以多糖及環(huán)烯醚萜苷中主要成分梓醇的含量作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)?？紤]到多次提取會(huì)提高多糖提取率，但因環(huán)烯醚萜苷類對(duì)熱不穩(wěn)定，不能長(zhǎng)時(shí)間煎煮，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中考慮到這些因素，對(duì)生地黃的提取時(shí)間、提取次數(shù)、溶媒用量進(jìn)行設(shè)計(jì)，優(yōu)選合理的提取條件。

對(duì)環(huán)烯醚萜苷類化合物含量測(cè)定的報(bào)道較少，文獻(xiàn)報(bào)道的方法有對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色－分光光度法、二階導(dǎo)數(shù)分光光度法，紫外分光光度法［3～6］。本實(shí)驗(yàn)曾采用二甲氨基苯甲醛顯色－分光光度法，以梓醇為對(duì)照品，經(jīng)酸水解，二硝基苯肼乙醇試液和NaOH 70%乙醇溶液顯色后在463nm處測(cè)定其含量［7］。本研究結(jié)果顯示，此方法顯色復(fù)雜，所得數(shù)據(jù)差異較大，穩(wěn)定性及重復(fù)性差，說(shuō)明此反應(yīng)不穩(wěn)定，其中影響因素過(guò)多，不易操作，且測(cè)定的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于實(shí)際含量。文獻(xiàn)報(bào)道中提出可對(duì)地黃中的總環(huán)烯醚萜類成分——梓醇進(jìn)行測(cè)定，其在210nm附近有最大吸收，從而對(duì)其水溶液直接采用紫外測(cè)定。但在實(shí)驗(yàn)中，因很多物質(zhì)在210nm都有吸收，加上藥液本身的顏色，種種因素都會(huì)對(duì)結(jié)果有較大的影響，最后導(dǎo)致了我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中測(cè)定的含量遠(yuǎn)高于實(shí)際含量，所以這個(gè)方法對(duì)于測(cè)定環(huán)烯醚萜的含量也不是很合適。因此，最終決定采用環(huán)烯醚萜苷中的主要成分梓醇作為評(píng)價(jià)總環(huán)烯醚萜苷含量的指標(biāo)。

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