賀雪姣，師建國，陳 果，李曉霞 (第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部病理生理學(xué)教研室，西安 710032;通訊作者，E-mail:2473632607@QQ．com)

表皮生長因子受體(epidermal growth factor，EGFR)是原癌基因c-erbB1的表達產(chǎn)物，是表皮生長因子受體(HER)家族成員之一，EGFR的過表達或異常表達與腫瘤細胞的增殖、血管的生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細胞凋亡的抑制有關(guān)，因此，EGFR是抗腫瘤藥物的一個理想靶點［1］。近年來，噬菌體展示技術(shù)作為新發(fā)展的一項分子生物學(xué)技術(shù)，在抗原和抗體研究方面得到了廣泛應(yīng)用。噬菌體隨機肽庫含有大量不同序列結(jié)構(gòu)多肽可作為任意靶抗原表位的模擬肽，運用肽庫篩選時不需要靶蛋白的任何結(jié)構(gòu)，只需靶抗原就可以獲得具有免疫原性和抗原性的多肽［2，3］，即為模擬表位，其能誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體既可以識別原始抗原又可以識別突變體［4］。

本研究應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)對EGFR模擬表位進行研究，以西妥昔單抗及尼妥珠單抗分別作為靶標(biāo)蛋白，擬通過親和篩選獲得與單抗特異性結(jié)合的噬菌體，從而獲得抗原模擬表位，為今后研制靶向EGFR抗體藥物提供導(dǎo)向作用。

1 材料與方法

1．1 材料

抗EGFR的單抗尼妥珠單抗購自百泰生物藥業(yè)有限公司，西妥昔單抗購自德國MERCK公司，噬菌體12肽庫試劑盒購于NEW ENGLAND Biolabs公司，測序引物及大腸桿菌2738試劑盒自帶。

1．2 方法

1．2．1 噬菌體12肽庫的生物淘洗 將濃度為40 μg/ml的西妥昔單抗和尼妥珠單抗150 μl分別包被于96孔酶聯(lián)板中，同時用150 μl包被液包被2孔，4℃，75 r/min搖床過夜;加滿牛血清白蛋白(BSA)緩沖封阻液，4 ℃，90 min;TBST(0．1%Tween-20)洗滌 6 次，每次 1 min，拍干;加 90 μl TBS，100 μl TBST 稀釋10 μl(1．5 ×1011pfu)噬菌體庫液，室溫搖動10 min，吸出噬菌體液，加至包被單抗的孔，室溫搖動10 min，以減少噬菌體非特異性吸附;TBST(0．5%Tween-20)洗滌10 次，每次1 min，拍干，洗去未結(jié)合的噬菌體，再加入100 μl甘氨酸緩沖液(pH 2．2)，室溫搖晃15 min，以洗脫結(jié)合的噬菌體，將洗脫液移入微量離心管中，加入15 μl Tris-HCl緩沖液(pH 9．1)中和，此即為噬菌體洗脫液。對洗脫液進行噬菌體計數(shù)及擴增，重復(fù)進行第二、三輪淘洗。在第二、三輪淘洗時，兩處需作改變，一是洗滌液變?yōu)門BST(0．5%Tween-20)，二是洗脫時先加入洗脫液30 s后棄去，再加入洗脫液15 min。其余步驟均相同，對每輪洗脫物均進行計數(shù)。

1．2．2 高滴度單克隆噬菌體的制備 從第三輪洗脫液滴度平板中，選擇＜100個藍斑的平板，挑選分隔良好的藍色單克隆噬菌斑，分別接種于1∶100稀釋的大腸桿菌ER 2378過夜培養(yǎng)液中，37℃，250 r/min搖床5 h;4 ℃，10 000 r/min，離心10 min，共 2次;取80%上清液，作為噬菌體儲存液，用于ELISA檢測及DNA提取。

1．2．3 ELISA檢測噬菌體陽性克隆 取4 ml儲存液，加入1/6體積的 PEG/NaCl，過夜，4℃，10 000 r/min，離心10 min;沉淀用1 ml TBS溶解，4℃，10 000 r/min離心5 min，上清液加入1/6體積的PEG/NaCl，冰上 1 h;4 ℃，10 000 r/min，離心10 min;沉淀用200 μl TBS溶解，測噬菌體滴度。將40 μg/ml的西妥昔單抗和尼妥珠單抗分別包被于96孔酶聯(lián)板中，4℃，75 r/min搖床過夜;棄包被液，加滿 BSA緩沖封阻液，4℃，2 h;TBST(0．5%Tween-20)洗滌8次，每次1 min，用力拍打;每孔中加入100 μl噬菌體液，病毒子量為1×1010個，以噬菌體原庫擴增液為陰性對照，37℃ 1 h;TBST(0．5%Tween-20)洗滌10 次，每次1 min，用力拍打;加100 μl HRP抗M13單抗(1∶4 000緩沖封阻液稀釋)37 ℃，1 h;TBST(0．5%Tween-20)洗滌10次，每次1 min，用力拍打;50 μl顯色液 A 和50 μl顯色液B避光顯色15 min，加入2 mol/L的H2SO4，終止后，經(jīng)酶標(biāo)儀波長450/630 nm讀OD值。

1．2．4 陽性噬菌體與西妥昔單抗及尼妥珠單抗結(jié)合的劑量依賴性 以5 mg/L西妥昔單抗及尼妥珠單抗分別包被96孔板，每孔100 μl，同時對每個西妥昔單抗及尼妥珠單抗包被孔分別設(shè)立噬菌體原庫擴增液的包被孔作為陰性對照，4℃孵育過夜。加入封閉液(5 mg/L BSA，0．1 mol/L NaHCO3，pH 8．6)，4℃封閉2 h，將陽性噬菌體稀釋至5×1014pfu/L后作倍比稀釋(pfu:噬菌斑形成單位)，直至其滴度為1．9×1010pfu/L，分別加入西妥昔單抗及尼妥珠單抗及噬菌體原庫擴增液包被孔，100 μl/孔，室溫孵育 2 h，每孔加入100 μl HRP 抗 M13(1∶4 000 緩沖封阻液稀釋)，室溫孵育1 h，測定A值。

1．2．5 單克隆噬菌體測序 取噬菌體儲存液4 ml，加 1．2 ml PEG/NaCl，混勻后室溫10 min;4 ℃，10 000 r/min離心10 min，沉淀用200 μl碘化物緩沖液懸浮，加入 500 μl乙醇，室溫靜置 10 min;4 ℃，10 000r/min離心10 min，沉淀用70%乙醇洗滌后干燥，20 μl雙蒸水溶解，此即為DNA溶液。送生工生物工程上海有限公司進行測序，測序引物為5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’，自備隨機肽庫試劑盒。用Chromas軟件讀取數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2．1 噬菌體肽庫的富集

以西妥昔單抗及尼妥珠單抗分別作為靶標(biāo)蛋白對噬菌體12肽進行3輪“吸附-洗脫-擴增”的生物淘洗，每輪淘洗結(jié)果均進行噬菌體滴度測定，西妥昔單抗篩選總體回收率從(6．67×10-8)%增加到(2．80×10-5)%，尼妥珠單抗篩選總體回收率從(8．67×10-8)%增加到(1．80 ×10-5)%(見表1)，可見通過三輪篩選兩種單抗噬菌體均得到富集，富集度分別達到420倍和208倍。

表1 西妥昔單抗和尼妥珠單抗篩選特異性噬菌體的富集Table 1 Specificity enrichment of cetuximab and nimotuzumab

2．2 ELISA檢測結(jié)果及陽性噬菌體特異性分析

分別隨機挑選30個單克隆噬菌體進行擴增，測噬菌體滴度，以噬菌體原庫做陰性對照，進行ELISA檢測，我們評價陽性結(jié)果為噬菌體單克隆OD值為噬菌體原庫OD值的2倍以上，確定分別有17個和21個陽性噬菌體，陽性率分別為56．67%和70%。挑選陽性噬菌體進行特異性分析，由圖1可見，隨著陽性噬菌體投入量的增大，A450nm值也增大，呈現(xiàn)劑量依賴性。

2．3 陽性噬菌體測序結(jié)果

對陽性克隆菌株提取單鏈DNA，對DNA序列測定，推導(dǎo)DNA序列編碼的氨基酸殘基，即為噬菌體遞呈的12肽序列。17個西妥昔單抗陽性噬菌體測序，翻譯成三段氨基酸序列分別為HSFKWLDSPRLR，HTSSLWHLFRST，HLFNHNKNLPKR;對 21個尼妥珠單抗噬菌體測序，翻譯成三段氨基酸序列分別為HSFKWLDSPRLR，HWKSSYVKWHNV，SQHIRT-WNGTRS。其中西妥昔單抗和尼妥珠單抗有一共有序列HSFKWLDSPRLR。

圖1 陽性噬菌體對西妥西單抗及尼妥珠單抗的結(jié)合依賴性實驗

3 討論

EGFR是很多正常的上皮組織(如皮膚和毛囊)組成性表達成分，在許多人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)EGFR過量表達，所以有效抑制EGFR的生物活性就有可能抑制腫瘤的發(fā)生、生長和發(fā)展［1，4，5］。西妥昔單抗和尼妥珠單抗都是以EGFR為靶點的嵌合型單克隆抗體，是EGFR拮抗劑。西妥昔單抗及尼妥珠單抗與EGFR的親和力比表皮生長因子高，因此具有阻斷表皮生長因子刺激細胞生長的功能［6，7］。在EGFR過度表達的頭頸癌和結(jié)直腸癌的治療過程中，可專一抑制癌細胞生長，減少了對其他正常細胞的影響，使藥物對癌癥病患產(chǎn)生的副作用相對減少，但其價格昂貴，且需長期重復(fù)使用，對患者及家屬造成了很大的經(jīng)濟負擔(dān)［1，6］。因此，我們采用噬菌體展示技術(shù)篩選與西妥昔單抗及尼妥珠單抗結(jié)合親和性較高的抗原表位肽作為腫瘤蛋白疫苗，以誘導(dǎo)活體發(fā)生主動免疫應(yīng)答，使患者體內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生相當(dāng)于西妥昔單及尼妥珠單抗具有生物學(xué)特性的抗體，作為腫瘤主動免疫治療的手段［8，9］。

本實驗采用西妥昔單抗和尼妥珠單抗對噬菌體隨機12肽庫進行了3輪生物淘洗，在特異性噬菌體得到富集后，隨機挑選30個噬菌體進行克隆，確證其中17個噬菌體克隆與西妥昔單抗具有較高的親和性，21個噬菌體克隆與尼妥珠單抗親和性較高，再提取噬菌體陽性克隆DNA進行序列分析，發(fā)現(xiàn)3段氨基酸序列，這一結(jié)果提示該12肽模擬了EGFR的表位。但同時發(fā)現(xiàn)陽性噬菌體與西妥昔單抗和尼妥珠單抗的結(jié)合力卻有差異，分析原因是噬菌體在擴增后滴度不同，導(dǎo)致噬菌體懸液與西妥昔單抗和尼妥珠單抗的結(jié)合力不同。

由于采用的西妥昔單抗和尼妥珠單抗對EGFR的生物活性有抑制功能，所以還需要進一步推測篩選到的抗原表位是否具有抑制EGFR活性或在體內(nèi)具有競爭性抑制作用［10，11，12］。

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