楊成德,王穎,王玉琴,姚玉玲,薛莉,徐長林,陳秀蓉
(草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅蘭州730070)
植物內(nèi)生細(xì)菌是指整個(gè)生活周期或部分階段在健康植物組織內(nèi)棲居而對(duì)植物不造成實(shí)質(zhì)性危害的細(xì)菌,即與植物建立了和諧聯(lián)合關(guān)系并與宿主協(xié)同進(jìn)化的微生物[1];一方面,植物體為其提供生長必需的場所和營養(yǎng)等;另一方面,部分內(nèi)生細(xì)菌具有抑菌、固氮、產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)及溶磷等生物功能,可以增強(qiáng)宿主植物的抗蟲性、抗病性、抗旱性及生長競爭能力等[2-3],其產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)、抗逆境相關(guān)酶的(超)表達(dá)及誘導(dǎo)抗性也能直接或間接有利于宿主植物,加強(qiáng)或調(diào)節(jié)了植物營養(yǎng)的獲得、新陳代謝和對(duì)逆境的忍耐能力等。因此,植物內(nèi)生細(xì)菌是一個(gè)潛在的巨大的微生物資源庫,其生物防治功能已成為內(nèi)生細(xì)菌研究的熱點(diǎn)之一。Liu等[4]報(bào)道了內(nèi)生沙雷氏細(xì)菌G3潛在的生防應(yīng)用價(jià)值;Vetrivelkalai等[5]報(bào)道了內(nèi)生菌對(duì)根結(jié)線蟲的防病潛力及對(duì)植物的促生潛力;高曉星等[6]和李振東等[7]報(bào)道了高寒草地珠芽蓼(Polygonumviviparum)等植物內(nèi)生細(xì)菌對(duì)多種植物病原真菌的抑制作用;也有學(xué)者[8-10]報(bào)道了植物內(nèi)生細(xì)菌的促生及對(duì)宿主真菌性病害的防御作用。醉馬草(Achnatherum inebrians)為禾本科(Gramineae)芨芨草屬(Achnatherum)的多年生草本植物,生命力和繁殖力極強(qiáng),有超強(qiáng)的耐旱力,是我國北方天然草原主要的烈性毒草之一,有關(guān)其內(nèi)生真菌的相關(guān)報(bào)道較多[11-12],內(nèi)生細(xì)菌方面張雪兵等[13-14]報(bào)道了在新疆的相關(guān)研究,高寒草地醉馬草內(nèi)生細(xì)菌的相關(guān)研究未見報(bào)道。高寒草地醉馬草內(nèi)生細(xì)菌生物功能如何?有沒有開發(fā)為生物農(nóng)藥的潛力?基于此,本試驗(yàn)對(duì)從東祁連山高寒草地醉馬草中分離獲得的6株內(nèi)生細(xì)菌的生物功能進(jìn)行了評(píng)價(jià),并利用16SrDNA序列分析,結(jié)合形態(tài)特征對(duì)其進(jìn)行了鑒定,以期為植物病害生物防治提供菌種資源,也為高寒草地醉馬草內(nèi)生細(xì)菌的開發(fā)利用提供依據(jù)。
1.1.1 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)用于植物病原真菌的培養(yǎng)和對(duì)峙試驗(yàn)、肉汁胨培養(yǎng)基(NA)用于內(nèi)生細(xì)菌的分離、純化和保存等[15],金氏(King)培養(yǎng)基用于產(chǎn)IAA試驗(yàn),Pikovaskaia培養(yǎng)基(PKO)和蒙金娜培養(yǎng)基分別用于溶解無機(jī)磷和有機(jī)磷試驗(yàn)。
1.1.2 供試菌 供試內(nèi)生細(xì)菌:2012年7月分離自東祁連山高寒草地醉馬草根和葉的內(nèi)生細(xì)菌。
供試病原菌:馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes),馬鈴薯枯萎病菌(Fusariumavenaceum)和馬鈴薯壞疽病菌(Phomafoveata),由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。
將醉馬草組織用自來水清洗表面,晾干后稱取2g,表面消毒后置于無菌研缽中研碎,吸取植物組織研磨浸出液按10倍濃度梯度稀釋后,取0.2mL涂布于NA培養(yǎng)基,以最后一次洗滌水為對(duì)照,28℃培養(yǎng)3~7d,根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小、邊緣整齊度及表面形態(tài)等分類,并純化后4℃保存?zhèn)溆茫?6]。
1.3.1 拮抗能力測定 采用平板對(duì)峙法[5,15,17]測定抑菌效果。用直徑5mm打孔器取指示菌菌塊置于PDA平板中央,在其四周等距離接種活化后的內(nèi)生細(xì)菌,4次重復(fù),馬鈴薯壞疽病菌置于20℃培養(yǎng),其他指示菌置于28℃培養(yǎng),至對(duì)照滿皿后測量菌落直徑,計(jì)算抑菌率。
1.3.2 固氮能力測定 供試內(nèi)生細(xì)菌菌懸液0.2mL接種于阿須貝無氮平板和液體培養(yǎng)基內(nèi),以無菌水為對(duì)照,3次重復(fù),平板置于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng),液體培養(yǎng)基置于120r/min振蕩培養(yǎng),第7天平板上有菌落和液體培養(yǎng)基變渾濁者為陽性,記為“+”,否則記為“-”。
1.3.3 溶磷能力測定 將0.2mL菌懸液涂布于Pikovaskaia’s培養(yǎng)基(PKO)[18]上,28℃培養(yǎng)14d后觀察解磷圈,3次重復(fù);根據(jù)解磷圈與菌落直徑比值大小確定其溶磷能力。
1.3.4 產(chǎn)IAA能力測定 采用Salkowski比色法[19]。將0.1mL菌懸液分別接種于含100mg/L色氨酸和不含色氨酸的金氏培養(yǎng)液中,以加等量無菌水為對(duì)照,于28℃、120r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12d,取50μL加入等量比色液(PC比色液或S2比色液),室溫靜置15min后,觀察顯色反應(yīng),3次重復(fù)均變紅色表示能分泌IAA,記“+”,否則記“-”。
1.4.1 培養(yǎng)形狀觀察[20]在NA固體培養(yǎng)基上觀察內(nèi)生細(xì)菌菌落形態(tài)特征并描述和照相。
1.4.2 形態(tài)觀察 內(nèi)生細(xì)菌在NA平板上經(jīng)18~24h活化培養(yǎng)后革蘭氏染色和鏡檢,觀察菌體顏色和形態(tài),隨機(jī)測量30個(gè)菌體的長和寬,并顯微拍照。
1.4.3 16SrDNA鑒定[5]利用16SrDNA通用引物,其序列為:引物1為5′-CCG GAT CCA GAG TTT GAT CAT GGC TCA GCA-3′,引物2為5′-CGG GAT CCT ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3′。內(nèi)生細(xì)菌活化后在LB培養(yǎng)液28℃振蕩過夜培養(yǎng),后按上海生工試劑盒說明書提取DNA,經(jīng)電泳檢測具特異性DNA條帶的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為:10×buffer 2.5μL,dNTP(5mmol/L)0.5μL,MgCl2(25mmol/L)2.5μL,TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.3μL,引物(10μmol/L)1和2各0.5μL,模板DNA 0.5μL(以加0.5μL ddH2O為對(duì)照),補(bǔ)ddH2O至25μL;擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min;94℃變性30s;65℃退火40s;72℃延伸90s;30個(gè)循環(huán);72℃延伸8min。經(jīng)電泳檢測在1500bp處具特異性條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物測序,與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列相似性比較(http:∥www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi),并用Clustal(1.8)軟件進(jìn)行多重序列比較和用 Mega(4.0)軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。
從接種醉馬草組織浸提液的平板上依據(jù)菌落形態(tài)、顏色和大小等挑取不同單菌落,反復(fù)劃線純化后從醉馬草中分離出6株內(nèi)生細(xì)菌,其中根部4株,葉部2株,分別編號(hào)為261MG1、261MG2、261MG3、261MG4、261MY5和261MY6,保存?zhèn)溆茫粚?duì)照沒有細(xì)菌菌落長出,說明表面消毒徹底,所得細(xì)菌均為內(nèi)生細(xì)菌。
經(jīng)對(duì)峙培養(yǎng),261MY5對(duì)3種指示菌的拮抗作用均較差,其他5株內(nèi)生菌株對(duì)3種指示菌均有較強(qiáng)的抑菌作用,其中對(duì)馬鈴薯壞疽病菌最強(qiáng)為261MY6,其抑菌率為69.62%,最弱為261MG3,其抑菌率為55.69%;對(duì)馬鈴薯枯萎病菌最強(qiáng)為261MY6,其抑菌率為64.51%,最弱為261MG1,其抑菌率僅為27.68%;對(duì)馬鈴薯炭疽病菌最強(qiáng)為261MY6,其抑菌率為83.65%,最弱為261MG2,其抑菌率也達(dá)73.39%。綜合來看,對(duì)馬鈴薯炭疽病的拮抗作用最明顯,其中261MY6對(duì)3種指示菌的拮抗作用最強(qiáng),其抑菌率最低也達(dá)69.62%,最高達(dá)83.65%(圖1,表1)。該結(jié)果說明6株醉馬草內(nèi)生細(xì)菌均具有抑菌能力,且多個(gè)菌株均具有一菌多防功能,在微生物農(nóng)藥開發(fā)中潛力巨大。
圖1 261MY6的抑菌作用Fig.1 The antagonism effect of 261MY6
表1 醉馬草內(nèi)生細(xì)菌的生物功能測定Table 1 Determination of biological functions on endophyte bacterium from A. inebrians
6株醉馬草內(nèi)生細(xì)菌中除261MG4外均能固氮,但均不能溶解有機(jī)磷,261MG4,261MG3和261MG6對(duì)無機(jī)磷有較弱的溶解能力,6株內(nèi)生細(xì)菌均能產(chǎn)IAA(表1)。該結(jié)果說明醉馬草內(nèi)生細(xì)菌具有功能多樣性。
2.3.1 培養(yǎng)形狀觀察 261MG1:菌落直徑3mm,圓形,邊緣整齊,表面褶皺,中心凹陷,呈草帽狀,較干燥,整體呈淡紅色,可產(chǎn)生紅色色素致培養(yǎng)基變紅(圖2)。
261MG2:菌落直徑13mm,不規(guī)則形,邊緣不整齊,表面褶皺,中心凹陷,較濕潤,產(chǎn)生紅色色素致培養(yǎng)基變紅(圖2)。
261MG3:菌落直徑5mm,橢圓或圓形,邊緣整齊,表面褶皺,菌落中央低陷,呈草帽狀,菌落呈淡紅色(圖2)。
261MG4:菌落直徑2mm,圓形,邊緣整齊,中心凹陷,呈草帽狀,菌落為淡紅色(圖2)。
261MY5:菌落直徑4mm,圓形,邊緣整齊,菌落隆起呈臺(tái)狀,半透明,米白色(圖2)。
261MY6:菌落直徑3mm,圓形,邊緣整齊,表面褶皺,中央稍低陷,奶白色(圖2)。
從6株內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)性狀看醉馬草內(nèi)生細(xì)菌在形態(tài)上存在多樣性。
圖2 內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)性狀Fig.2 Culture character of endophyte bacterium from A. inebrians
圖3 內(nèi)生細(xì)菌的革蘭氏染色Fig.3 Gram stain of endophyte bacterium from A. inebrians
2.3.2 形態(tài)觀察 6株醉馬草內(nèi)生細(xì)菌均為革蘭氏陽性和桿狀(圖3),但菌體大小差別較大,菌體最長的為261MG3,其長度達(dá)2.09μm,菌體最寬的為261MG2,其寬度為0.77μm,其他菌株長和寬介于這兩數(shù)值間(表2)。
2.3.3 16SrDNA鑒定 獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹表明,261MG1、261MG2、261MG3和261MY6分別與芽孢桿菌屬的Bacillussubtilis(JX848636)、Bacillusaxarquiensis(GU568194)、Bacillusmojavensis(JF496257)和Bacillusamyloliquefaciens(KC752450)的一致性在99%以上,且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起(圖4),初步將其分別鑒定為芽孢桿菌屬的Bacillussubtilis、Bacillusaxarquiensis、Bacillusmojavensis和Bacillusamyloliquefaciens,261MG4與Brevibacteriumhalotolerans(HE970648)的一致性在99%以上,且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起(圖4),初步鑒定其為短桿菌屬的Brevibacteriumhalotolerans,261MY5與Clavibactersp.(JX164054)的一致性在99%以上(圖4),且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起,初步鑒定其為棒形桿菌屬細(xì)菌。該結(jié)果表明,6株內(nèi)生細(xì)菌分屬于3個(gè)屬6個(gè)種,說明醉馬草內(nèi)生細(xì)菌也具有種類多樣性,但芽孢桿菌屬細(xì)菌4株,占66.7%,為優(yōu)勢類群。
表2 內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)特征Table 2 Morphological character of endophyte bacterium from A. inebrians
圖4 醉馬草內(nèi)生細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of endophyte bacterium from A. inebrians
植物內(nèi)生細(xì)菌分布廣、種類多,幾乎存在于所有已研究過的陸生及水生植物中,在各種農(nóng)作物及經(jīng)濟(jì)作物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生細(xì)菌已超過120種[21];由于內(nèi)生菌生境的特殊性,其產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)、抗逆境相關(guān)酶的(超)表達(dá)及誘導(dǎo)抗性均直接或間接有利于宿主植物,即存在內(nèi)生細(xì)菌的宿主植物往往具有生長快速、抗逆境和抗病害等特點(diǎn),比未感染內(nèi)生菌的植物更具生存競爭力。內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)具有獨(dú)立繁殖和傳導(dǎo)特性,且很多內(nèi)生細(xì)菌具有拮抗和促生作用,具有開發(fā)為微生物農(nóng)藥和肥料的潛力。所以,拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選和應(yīng)用在提倡綠色農(nóng)藥的今天也逐漸成為植物病害防治研究中的熱點(diǎn)[21-22]。本試驗(yàn)從醉馬草體內(nèi)分離出6株內(nèi)生細(xì)菌,其中有5株對(duì)馬鈴薯壞疽病菌有較好的抑制效果,最高抑菌率達(dá)69.62%,4株對(duì)馬鈴薯枯萎病菌有較好的抑制效果,最高抑菌率達(dá)64.51%,對(duì)馬鈴薯炭疽病的拮抗作用最明顯,最低抑菌率達(dá)73.39%。6株醉馬草內(nèi)生菌中261MY6具有一菌多防的效果,且具有固氮、溶磷和產(chǎn)生IAA能力,是開發(fā)植物病害生物菌劑的良好菌種資源;其他菌株單用功能略低于261MY6,可以通過篩選協(xié)同作用的菌株復(fù)配以提高其生物功能,如張英等[23]報(bào)道菌株復(fù)配后產(chǎn)IAA量顯著高于單菌株。6株內(nèi)生細(xì)菌在形態(tài)、大小及培養(yǎng)性狀上均有差異,根據(jù)培養(yǎng)性狀及16SrDNA序列分析鑒定6株內(nèi)生細(xì)菌分屬于3個(gè)屬6個(gè)種,其中芽孢桿菌屬細(xì)菌占4株,占66.7%。該結(jié)果說明醉馬草內(nèi)生細(xì)菌具有功能、種類及形態(tài)多樣性,且芽孢桿菌為主要類群[24]。本試驗(yàn)從醉馬草根部獲得4株,葉片獲得2株,總體數(shù)量較少,此可能與東祁連山高寒草地醉馬草本身有關(guān)系,同樣的分離方法從線葉嵩草(Kobresiacapillifolia)及針茅(Stipacapillata)等植物中均可分離獲得較多的菌株;也可能與所使用培養(yǎng)基有關(guān)系,醉馬草內(nèi)生細(xì)菌需要的營養(yǎng)組成與其他牧草內(nèi)生細(xì)菌有差異,致分離數(shù)量偏少;或可能與消毒使用的消毒劑有關(guān)系,化學(xué)方法可能殺死部分內(nèi)生細(xì)菌,導(dǎo)致內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量或種類減少[3],但此有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)關(guān)于醉馬草內(nèi)生細(xì)菌的防病促生研究主要集中在室內(nèi),豐富了東祁連山高寒草地內(nèi)生細(xì)菌的研究,但這些內(nèi)生細(xì)菌能否開發(fā)為微生物農(nóng)藥或肥料應(yīng)用于生產(chǎn)有待于進(jìn)一步研究。
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