王蔚芳，李青梅，柴書軍，甘玲玲，洪 磊，郭軍慶，雷霽霖

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，青島市海水魚類種子工程與生物技術重點實驗室，山東青島266071；

2.河南省農業(yè)科學院，河南省動物免疫學重點實驗室，鄭州450002；3.四川省富順縣水產漁政局，四川富順643200）

1 前言

大菱鲆（Scophthalmus maximus）是20世紀90年代由歐洲引進我國的名貴魚種，在突破繁育、創(chuàng)建“溫室大棚+深井海水”養(yǎng)殖模式的基礎上，如今歷經20年風雨的大菱鲆養(yǎng)殖產業(yè)已經展現(xiàn)出強大的生命力和發(fā)展?jié)摿Γ⒊蔀槲覈S化養(yǎng)殖的樣板工程，帶動了沿海其他養(yǎng)殖魚類產業(yè)的提升與轉型。然而在其工業(yè)化發(fā)展進程中，循環(huán)水、高密度的養(yǎng)殖模式對疾病防控技術的要求亟待提升。在當前日益增長的環(huán)保理念和食品安全意識的要求下，以疫苗等為主要代表的免疫病害防控技術受到重視，通過免疫防控途徑能有效增強魚體主動防御能力，減少疾病的發(fā)生概率[1]。然而對大菱鲆免疫學的研究報道有限，Kofod等[2]分離純化了大菱鲆免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM），Estévez等[3]制備了大菱鲆免疫球蛋白單克隆抗體，王賢麗等[4]從大菱鲆脾臟cDNA文庫中篩選得到了免疫球蛋白L輕鏈的全長cDNA片段，馮守明等[5]對大菱鲆免疫相關組織中免疫球蛋白陽性細胞進行了檢測，丁冰潔等[6]首次得到了大菱鲆多聚免疫球蛋白受體完整的cDNA序列。未見大菱鲆IgM單克隆抗體相關研制和應用的報道。

單克隆抗體具有均一性、高效性、特異性、生物活性單一性及可無限供應等特點，將單克隆抗體技術應用于大菱鲆免疫球蛋白結構和功能分析、病原和抗體檢測、疫苗研制及免疫應答規(guī)律研究等方面具有科學理論意義和生產應用價值。因此，本研究將純化的大菱鲆IgM免疫BALB/C小鼠，利用細胞工程技術生產融合的雜交瘤細胞，篩選分泌大菱鲆IgM的單克隆抗體雜交瘤細胞，制備并生產大菱鲆IgM單克隆抗體。

2 材料與方法

2.1 免疫原制備

純化的大菱鲆血清IgM由本實驗室制備并保存[7]。將純化的大菱鲆IgM分別與等體積的弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑（Pierce，USA）混勻乳化后免疫小鼠。

2.2 免疫動物

選用6周齡BALB/C雌性小鼠進行免疫，免疫程序見表1。

表1 免疫程序Table 1 The immunization schedule

2.3 飼養(yǎng)細胞制備

脫頸椎處死正常BALB/C小鼠，無菌條件下剪開腹部皮毛，用注射器吸取5m LRPM I-1640培養(yǎng)基（含10%新生牛血清和1%次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷溶液）后注射到小鼠腹膜內，同時輕壓小鼠腹腔，然后將培養(yǎng)基吸入注射器內并移出；將吸出的腹腔液轉移到24孔細胞培養(yǎng)板中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待用。

2.4 細胞融合

1）脫頸椎處死免疫小鼠，無菌取出脾臟，過100目篩網(wǎng)后用GNK（葡萄糖、NaCl、KCl、酚紅及磷酸鹽）溶液洗滌2次，然后溶于10m LGNK溶液，吹打形成單細胞懸液。

2）取105個處于對數(shù)生長期的NS0骨髓瘤細胞（由英國國家動物健康研究院惠贈），1 000 r/m in，離心10 min，棄上清液，用40m L GNK溶液重懸沉淀物。

3）將脾細胞懸液和骨髓瘤細胞懸液混合均勻后，1 000 r/m in，離心10m in，完全吸除上清液，輕彈離心管底，打散細胞，放入37℃水浴中；加入37℃預熱好的聚乙二醇溶液1m L，在1m in內滴加完，然后在37℃水浴中緩慢轉動90 s。

4）加入已經預熱到37℃的GNK溶液15m L（開始緩慢滴加，后來逐漸加快速度），然后繼續(xù)緩慢滴加GNK溶液至40m L，并在37℃水浴中靜置5m in。

5）1 000 r/m in，離心10m in，用預熱好的RPM I-1640培養(yǎng)基（含10%新生牛血清和1%次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷溶液）稀釋沉淀的細胞，然后加到96孔含飼養(yǎng)細胞的細胞培養(yǎng)板中。

6）將培養(yǎng)板放入二氧化碳培養(yǎng)箱（二氧化碳5%，37℃）中培養(yǎng)，并在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，大概5～7天后進行換液，吸出100μL培養(yǎng)液，更換等量含次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷溶液的培養(yǎng)液。

2.5 陽性雜交瘤細胞株的篩選

細胞融合后10天左右，觀察細胞生長狀態(tài)良好并開始檢測篩選，將篩選的陽性雜交瘤細胞轉移到24孔細胞培養(yǎng)板中進行擴大培養(yǎng)。酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）法檢測篩選步驟如下：以0.05mol/L（pH=9.6）碳酸鹽溶液稀釋大菱鲆免疫球蛋白至2μg/m L，取50μL稀釋液加入酶標板孔中，置于4℃冰箱中過夜包被，次日以0.01mol/L（pH=7.4）磷酸鹽-吐溫溶液（PBST，0.05%Tween-20）洗滌3次，每次3m in；用5%豬血清于37℃封閉1 h，封閉結束后以PBST同法洗滌；加入雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，每孔加入50μL，陰性對照為細胞培養(yǎng)基，陽性對照為免疫小鼠血清，于37℃反應15min后以PBST同法洗滌；然后每孔加入50μL羊抗鼠IgGHRP（1∶1 000稀釋），于37℃ 反應30m in后洗滌；每孔加入新配制的50μL顯色液TMB（四甲基聯(lián)苯胺）顯色5m in后，加入2mol/L硫酸溶液50μL終止反應；結果判定用自動酶標儀讀取OD450值（P/N≥2.1時判定為陽性）。

2.6 陽性雜交瘤細胞系的建立與克隆

采用有限稀釋法對篩選出的陽性雜交瘤細胞進行克?。涸?6孔細胞培養(yǎng)板各孔中加入100μL的飼養(yǎng)細胞；然后把要克隆的陽性雜交瘤細胞孔中的細胞用血球計數(shù)板進行計數(shù)，用培養(yǎng)液以10倍梯度進行稀釋，取出100個雜交瘤細胞；將取出的雜交瘤細胞混勻后，滴加到鋪滿飼養(yǎng)細胞的96孔板中，每孔加入100μL，平均每孔含有一個雜交瘤細胞；然后放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。期間，定期觀察細胞生長狀況并記錄，并通過上述ELISA法檢測各培養(yǎng)孔的上清液（確保陽性率100%），把所得陽性克隆孔的雜交瘤細胞按上述方法再克隆一次，以保證形成單克隆。

2.7 腹水制備（單抗大量生產）

1）小鼠預處理：在接種雜交瘤細胞前1周，用0.5m L液體石蠟腹腔注射正常BALB/C小鼠。

2）接種雜交瘤細胞：將培養(yǎng)的雜交瘤細胞離心，棄去上清，雜交瘤細胞用無血清培養(yǎng)液懸浮，并將細胞數(shù)調至106/m L，每只小鼠腹腔注射0.5m L。

3）采集腹水：接種雜交瘤細胞后約7～12天，小鼠腹部可見明顯膨大。用75%酒精棉球消毒腹部皮膚后，用注射器抽取腹水。每只小鼠抽取腹水2m L，間隔5天后，待腹水再生積聚后，同法抽取。

4）腹水處理：收集的腹水3 000 r/m in離心20min，收集上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.8 單抗特性鑒定

2.8.1 ELISA法測定單抗效價

以2μg/m L純化大菱鲆免疫球蛋白包被酶標板，每孔50μL，4℃過夜，封閉后加細胞上清液和腹水抗體，細胞上清液從1∶100倍比稀釋到1∶12 800，腹水從 1∶1 000倍比稀釋到 1∶2 048 000，每孔50μL，其余步驟同2.5節(jié)。

2.8.2 單抗靈敏度的測定

純化的大菱鲆IgM起始濃度為2μg/m L，倍比稀釋至2 ng/m L，每孔50μL，4℃過夜包被，封閉洗滌后滴加單抗（1∶25 000），每孔50μL，其余步驟同2.5節(jié)。

2.8.3 單抗Western blot分析

SDS-PAGE分離純化的大菱鲆免疫球蛋白（凝膠由10%分離膠和3%濃縮膠組成），將電泳凝膠轉印到硝酸纖維素膜（孔徑0.22μm）上，轉印完畢將硝酸纖維素膜用脫脂奶粉封閉1 h，PBST洗滌后將硝酸纖維素膜置于腹水稀釋液中（1∶250 000）緩慢搖動1 h，同法洗滌后，將硝酸纖維素膜置于羊抗鼠IgG-HRP（1∶500稀釋）緩慢搖動1 h，同法洗滌后，將硝酸纖維素膜放入HRP-DAB底物顯色液中，至顏色清晰為止，然后將硝酸纖維素膜用去離子水沖洗干凈后，置于濾紙間干燥，拍照記錄后暗處保存。

2.8.4 單抗特異性的測定

收集大菱鲆、褐牙鲆、半滑舌鰨、紅鰭東方鲀、鯉魚、鯽魚、草魚、鳙魚、許氏平鲉、六線魚、鱸魚血清，待檢魚血清用包被液以1：100倍稀釋后包被于酶標板，每孔50μL，4℃過夜，封閉洗滌后加單抗（1∶25 000），每孔50μL，其余步驟同2.5節(jié)。

3 結果

3.1 單抗的篩選

采用上述免疫和細胞融合方法，用直接ELISA法對培養(yǎng)的雜交瘤細胞進行篩選，獲得4株陽性雜交瘤細胞，編號分別為B1D1、D5C2、E1B2、F4A1。雜交瘤細胞經過3次亞克隆篩選，保證100%的陽性率，經連續(xù)傳代培養(yǎng)后依然能夠穩(wěn)定分泌抗體。

3.2 單抗特性鑒定

經直接ELISA法檢測，4株單抗的細胞培養(yǎng)上清效價為1∶1 280～1∶2 560，其中E1B2的細胞上清及腹水效價分別為1∶2 560和1∶1.024×106。

用不同濃度的大菱鲆IgM包被96孔板，ELISA法測定單抗E1B2的敏感性，結果表明E1B2腹水對大菱鲆IgM的檢測靈敏度為32 ng/m L。

應用SDS-PAGE技術，對獲得單抗進行Western blot分析，結果表明單抗能與大菱鲆IgM發(fā)生特異性結合，特異識別IgM重鏈區(qū)（見圖1）。

圖1 單抗的Western blot圖譜Fig.1 Western blot analysis of monoclonal antibody against IgM of turbot

3.3 單抗特異性測定

將單抗與不同種類的魚血清進行ELISA反應，結果表明單抗與大菱鲆血清呈強陽性反應，與褐牙鲆、紅鰭東方鲀、許氏平鲆、六線魚、鱸魚均呈微弱陽性反應，而與半滑舌鰨、鯉魚、鯽魚、草魚、鳙魚的血清無交叉反應（見圖2）。

圖2 ELISA法檢測單抗與各種魚血清的交叉反應Fig.2 The reaction of monoclonal antibody again stserum from eleven species of fish by ELISA

4 討論

單克隆抗體能夠特異性識別單一抗原決定簇，且經過多次克隆和篩選獲得，從而避免交叉反應帶來的假陽性，提高檢測的準確性，檢測靈敏度可達到納克水平，是免疫學和血清學研究的重要工具。魚類是具有細胞免疫和體液免疫系統(tǒng)的最低等的脊椎動物，已報道在魚類免疫系統(tǒng)中存在4種主要的免疫球蛋白（IgM、IgD、IgT和IgZ）[8]，其中IgM發(fā)現(xiàn)最早、研究最多。魚類免疫球蛋白的單抗不僅可以用于魚類免疫細胞的鑒定、發(fā)生和活性研究，也可用于監(jiān)測病原感染或疫苗接種過程中的免疫應答反應，是魚類免疫機理和魚病免疫防治研究的有力工具。

在大菱鲆IgM單抗制備過程中，免疫原IgM的提純是關鍵的一步。通常免疫原越純，單抗效果越佳。在本研究中，大菱鲆IgM的提取和純化是建立在實驗室已經完成的相關工作基礎上進行的，獲得的IgM純度高，經SDS-PAGE檢驗，大菱鲆血清IgM有兩條帶，分子質量分別是76 kD和27 kD，代表免疫球蛋白的重鏈和輕鏈，條帶清晰，無雜帶[7]。在此基礎上，將其免疫小鼠，通過細胞融合及多次克隆和篩選，獲得了穩(wěn)定分泌大菱鲆IgM的雜交瘤細胞株。生產的單抗效價高（1∶1.024×106）、檢測靈敏度高（32 ng/m L），有效保證其在大菱鲆相關免疫學研究中的應用。

本研究通過Western blot方法對制備單抗的特性鑒定分析表明，單抗能特異識別大菱鲆IgM的重鏈。在草魚、歐洲鰻、花鱸、南方鲇等魚血清IgM單抗研究中也發(fā)現(xiàn)，大部分單抗僅識別IgM重鏈[9～12]。這可能是由于IgM分子重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列多、結構復雜，可提供多個抗原表位；而輕鏈相對簡單，其上免疫表位少，所以篩選到的強陽性細胞株大部分是抗重鏈的，而在篩選過程中抗輕鏈的雜交瘤細胞很容易被放棄和丟失。

在交叉實驗中，研制的單抗與半滑舌鰨及草魚、鯉魚、鳙魚、鯽魚4種淡水魚類的血清無交叉反應，與鱸魚、六線魚、許氏平鲉、紅鰭東方鲀、牙鲆五種海水魚類血清有微弱的交叉反應，而與大菱鲆的血清反應是最強烈的，表明該單抗具有較好的特異性。同時，也可以看出，不同魚類的免疫球蛋白存在特異性抗原位點，但也存在相同的抗原決定簇，這種共同的抗原決定簇會存在于親緣關系較近的品種之間。

5 結語

單克隆抗體技術在人類及畜牧業(yè)的疾病控制與預防中發(fā)揮著重要作用，是疾病的檢測、預防和治療的有力武器。單克隆抗體能夠在實驗室通過細胞培養(yǎng)而得到批量生產，在應用上具有專一性強、重復性好、操作簡便等優(yōu)點，有較高的科研應用價值和生產實際應用前景。本研究制備的大菱鲆IgM單克隆抗體效價高、靈敏度高、特異性強，適合用于大菱鲆免疫學相關研究和生產實際應用。

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