肖婧凡，王 玥，張元興，雷霽霖

(1.華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海200237；2.中國水產科學院黃海水產研究所，山東青島266071)

1 前言

21世紀人類社會面臨著“人口劇增、資源匱乏、環(huán)境惡化”三大問題的嚴峻挑戰(zhàn)，隨著陸地資源的日益減少及天然漁業(yè)的日漸枯竭，水產養(yǎng)殖業(yè)顯得日益重要。由于水土資源有限，從提高養(yǎng)殖面積來增加產量難以持續(xù)發(fā)展。因此，規(guī)?；?、集約化、高密度養(yǎng)殖模式逐漸成為我國海水魚類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展主流。工廠化養(yǎng)殖模式和高密度網箱養(yǎng)殖模式也成為今后海水養(yǎng)殖的一個必然趨勢。

隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，各種病害問題日益突出，對養(yǎng)殖的產量及成長造成嚴重影響。目前，我國的海水養(yǎng)殖水產動物的病害種類達200余種，常年養(yǎng)殖病害發(fā)病率達50%以上，損失率30%左右，估計每年因水產養(yǎng)殖病害問題而造成的直接經濟損失就達百億元，并且還有上升的趨勢，病害問題已成為制約海水養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素[1]。根據(jù)2006年統(tǒng)計的我國水產養(yǎng)殖疾病種類的檢測結果可知：在128種病害中病毒性疾病17種，細菌性疾病61種，真菌性疾病4種，寄生蟲疾病28種，藻類性疾病6種，其他病害3種，不明病因9種[2]，細菌性疾病的比例約占一半。由此可見，由細菌性感染引起的養(yǎng)殖魚類病害已成為造成我國水產養(yǎng)殖魚種經濟損失的一個主要原因。

2 國內外海水養(yǎng)殖主要細菌性病害

水產養(yǎng)殖病害研究一直是世界各國學者關注的熱點，國外對養(yǎng)殖魚類病害的研究歷史較早，也較深入，其中針對水產養(yǎng)殖細菌性病害的研究占到很大比例，主要集中在造成較大經濟損失的致病性弧菌、嗜水氣單胞菌、假單胞菌、愛德華氏菌等細菌性病原[3]。

2.1 弧菌病

弧菌病是國內外海水養(yǎng)殖業(yè)中常見的疾病，常見的致病菌有鰻弧菌（Vibrio anguillarum）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）、哈維氏弧菌（V.harveyi）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、殺鮭弧菌（V.salmonicida）等，其中鰻弧菌是弧菌病的典型病原菌，在國內外均對重要的經濟養(yǎng)殖品種造成嚴重的病害。殺鮭弧菌為冷水弧菌病的病原，主要出現(xiàn)在加拿大和北歐國家（主要是挪威和英國），對大馬哈魚和鱈魚養(yǎng)殖造成了很大危害[4～6]。此外，哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌及溶藻弧菌也是海水養(yǎng)殖中常見的致病菌，對花鱸魚、石斑魚、鰻鱺、對蝦和大黃魚養(yǎng)殖造成巨大經濟損失[7～9]。

2.2 愛德華氏菌病

由遲鈍愛德華氏菌(E.tarda)引起的愛德華氏菌病是一種危害巨大的魚類病害，在世界許多國家都有相關病例的報道，可感染多種魚類。目前遲鈍愛德華氏菌病已成為鰻鱺養(yǎng)殖中危害最大的一種病，2002年在中國北方大菱鲆養(yǎng)殖區(qū)出現(xiàn)E.tarda感染病例。到2004年，該病已呈頻繁暴發(fā)態(tài)勢，給大菱鲆養(yǎng)殖帶來巨大經濟損失。據(jù)報道，大連地區(qū)養(yǎng)殖的大菱鲆由于E.tarda感染而引發(fā)的出血性腹水病的發(fā)病率高達70%～80%，體長10～15 cm的病魚死亡率高達90%～95%[10]。

2.3 假單胞菌病

鰻敗血假單胞菌（Pseudomonas anguilliseptica）被認為是養(yǎng)殖魚種的重要病原。該菌在1972年被描述為紅點病的發(fā)病病原，造成養(yǎng)殖日本鰻大量死亡[11]。此后，該菌在臺灣、蘇格蘭和丹麥的歐洲鰻的養(yǎng)殖場被報道[12]。除感染鰻魚，該菌還是大菱鲆和黑斑小鯛魚種的新發(fā)病原[13]，主要在冬季時低溫條件下發(fā)?。?6℃以下），感染此敗血癥的魚腹部膨大、表皮和內臟出現(xiàn)出血潰瘍點。

2.4 細菌性腎?。╞acterial kidney disease，BKD）

BKD是由鮭魚腎桿菌（Renibacterium salmoninarum）造成的，對于淡水和海水養(yǎng)殖魚種有很高的致死率[14～16]。BKD在北美、日本、西歐和智利已有所報道，對太平洋鮭魚的經濟效益影響尤其大。在出現(xiàn)感染的臨床癥狀前該病原菌能通過有性垂直傳播給下一代，目前主要的治療手段對此疾病都基本無效。

3 國內外海水養(yǎng)殖品種主要病害檢測方法

針對以上養(yǎng)殖魚種主要細菌性病害，各國研究人員為開發(fā)快速、準確、有效的診斷方法廣泛開展工作。筆者等將目前已報道的國內、國外主要海水養(yǎng)殖細菌性病害檢測方法總結為以下幾種類型進行敘述。

3.1 基于微生物生理生化檢測的方法

針對養(yǎng)殖魚種細菌性病原的檢測，最經典的鑒定方法是對病原進行分離純化，基于形態(tài)學檢測、生理學和通過一系列的生理生化實驗實現(xiàn)對微生物的初步鑒定[17]。然而，這種方法耗時長、操作繁瑣，不利于細菌性病害的快速診斷。法國生物梅里埃公司于1970年開發(fā)出一系列微生物鑒定用生理生化檢測試劑盒，使細菌鑒定更簡單快捷。該系列試劑盒已成為國際公認的鑒定細菌的參考標準，目前在海水養(yǎng)殖魚類細菌性病害的診斷中，已將API系列試紙條檢測結果作為鑒定的輔助手段之一。Abdel-Aziz等[18]采用API 20NE生理生化檢測試劑盒與分子鑒定相結合，對導致埃及沿海養(yǎng)殖金頭鯛和歐洲海鱸大量死亡的病原進行了鑒定，確定了溶藻弧菌、副溶血弧菌和美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種造成病害的主要病原。潘曉藝等[19]根據(jù)API20E結果結合16S rDNA和gyrB基因序列比對，確定從發(fā)病養(yǎng)殖中華鱉肝臟分離得到的一株致病菌為遲鈍愛德華氏菌。

除了API系列檢測試劑盒，針對一些特殊的細菌性病原還可以采取更為簡便的顯色培養(yǎng)技術[20]。該技術在培養(yǎng)基中加入細菌特異性酶的顯色底物，使菌落出現(xiàn)不同顏色而達到分離鑒定的目的，如硫檸膽蔗瓊脂（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar，TCBSagar）已經被廣泛用于霍亂弧菌和副溶血弧菌的分離鑒定。近年來還有很多新型顯色培養(yǎng)基被開發(fā)出來，如選擇性顯色弧菌培養(yǎng)基（vibriobiochrome medium，BCVM），副溶血弧菌在其上生長形成的菌落呈紫色，而其他弧菌則呈藍綠色，可以更有效的將副溶血弧菌與其他致病性弧菌區(qū)分開來。目前這種方法不僅被廣泛用于人類病原菌的初步分離鑒定，也越來越多地被應用到水產養(yǎng)殖業(yè)病害檢測中。

3.2 基于分子生物學技術的檢測方法

基于分子生物學技術的養(yǎng)殖魚類細菌性病害的檢測方法在已有報道文獻中占到50%以上，該方法與傳統(tǒng)的生理生化檢測方法相比簡潔、快速、靈敏度高、特異性強，可用于細菌性病害疾病的預警和診斷。

3.2.1 聚合酶鏈反應技術

聚合酶鏈反應或稱多聚酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)，是根據(jù)生物信息學等方法尋找特定病原菌特異性基因序列設計特異性引物，擴增后產生特異性片段從而達到檢測病原菌的目的[21]。目前多數(shù)文獻針對不同細菌性病害的特異性基因序列設計引物，建立了靈敏有效的檢測方法。Pinto等[22]以toxR，tlh，tdh和trh作為目的基因實現(xiàn)了副溶血弧菌的檢測；Lee等[23]以創(chuàng)傷弧菌溶血素為靶標，設計特異性引物建立其PCR檢測方法。隨著PCR技術的成熟，基于多種病菌的同時檢測的多重PCR技術逐漸發(fā)展起來。Kong等[24]建立了一種以嗜水氣單胞菌的氣單胞菌溶素基因、弗氏志賀菌ipaH基因、鼠傷寒沙門氏菌ipaB基因、霍亂弧菌epsM基因和副溶血弧菌16 S-23 S rDNA為目標基因，設計六對擴增后可產生6種不同長度的片段的特異性引物來快速同時檢測水產品中這6種致病菌。此檢測方法可在12 h內完成，檢測限可以達到100～102CFU/m L。

3.2.2 環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification， LAMP）

由于傳統(tǒng)的PCR技術需要精確控制擴增反應各階段溫度，一定程度上限制了其在水產養(yǎng)殖業(yè)中的應用。Notomi等[25]于2000年提出的一種只需在恒溫條件下就可以進行核酸擴增的LAMP技術。LAMP通過設計兩對特別的引物（內引物和外引物）在一種有鏈置換活性的DNA聚合酶作用下進行的一種自動鏈置換DNA合成反應。因為DNA在65℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)，任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離成為單鏈，所以該技術在恒溫下就可以進行核酸擴增[26]，已被用于多種水產養(yǎng)殖細菌性病害的檢測。Yeh等[27]根據(jù)鯰魚愛德華氏菌eip18基因設計引物進行LAMP擴增，在65℃反應60m in后可得到鯰魚愛德華氏菌基因特異性條帶，檢測限可達到20 CFU/m L，可以從養(yǎng)殖水體樣本中實現(xiàn)鯰魚愛德華氏菌的檢出。Surasilp等[28]將LAMP與橫向流動試紙條分析相結合，以rpoS基因為靶基因建立了一種LAMP-LFD方法來檢測創(chuàng)傷弧菌，對于純培養(yǎng)檢測限可達到1.5×103CFU/m L。

3.2.3 實時定量PCR技術（quantitative real-time polymerase chain reaction， qRT-PCR）

qRT-PCR目前也被廣泛用于水產養(yǎng)殖病害的定量檢測。該技術特異性強、靈敏度高、重復性好，可同時檢測同一樣本中不同靶序列。Blackstone等[29]以TaqMan探針為基礎，采用qRT-PCR技術以副溶血弧菌特異性tdh基因來檢測副溶血弧菌，檢測限可達到每PCR體系1 CFU。Panicker等[30]針對vvh基因設計寡核苷酸引物，建立了以SYBRGreen I染料為基礎的qRT-PCR快速、特異性地檢測牡蠣組織勻漿和墨西哥灣水體中的創(chuàng)傷弧菌。該方法對于純基因組DNA的最低檢測量為1 pg，水體中檢測限可達10CFU/m L。許龍巖等[31]根據(jù)副溶血弧菌toxR基因和tdh基因設計引物對副溶血弧菌建立了一種基于TaqMan探針的雙重熒光PCR檢測法。該方法具有良好的特異性，水體中常見非副溶血弧菌細菌均呈陰性，副溶血弧菌的菌濃度與Ct值的反向線性關系良好，檢測限為3.6×102CFU/m L。

3.2.4 基因探針技術

自1975年DNA探針雜交技術被首次提出，基因探針技術已得到了很大的進步和發(fā)展。該技術的基本依據(jù)是核酸雜交，針對決定病原菌生物體特性的DNA序列設計特異性標記的DNA或RNA探針，就可以通過樣品與探針雜交是否形成雜交分子來檢測是否存在目標病原菌?；蛱结樀臉擞浄椒ㄖ饕蟹派湫詷擞浄ê头欠派湫詷擞浄▋煞N。目前常用的標記物為堿性磷酸酶（AP）和地高辛（DIG）。該技術除用于人類病原診斷，也被用于水產養(yǎng)殖病原檢測中。周鳳麗等[32]針對溶藻弧菌膠原蛋白酶基因和外膜蛋白基因設計了兩對引物對溶藻弧菌進行PCR擴增，對擴增產物以DIG標記制備基因探針用于檢測溶藻弧菌，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白酶基因探針有較高特異性，可用于對溶藻弧菌的檢測鑒定分析。Raghunath等[33]用AP來標記基因探針檢測海洋食品中的trh+副溶血弧菌，對40株副溶血弧菌、45株其他弧菌和55株非弧菌進行探針雜交，特異性達100%，檢測限達到5.0×102～3.4×103CFU/g。

3.3 基于免疫學相關技術的檢測方法

除分子生物學技術外，免疫學相關技術也被廣泛用于水產養(yǎng)殖品種病害診斷?；诿庖邔W相關的檢測方法利用抗原抗體特異性結合的原理，目前應用較多的有酶聯(lián)免疫吸附法和免疫層析技術。

3.3.1 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）

ELISA技術最早出現(xiàn)于1971年，該技術的基礎是抗原抗體特異性反應，常用的ELISA方法有競爭法測抗原、間接法測抗體和雙抗體夾心法，其特異性取決于抗體的特異性[34]。Sm ith等[35]最早將ELISA應用于魚癤病的診斷，靈敏度達102CFU/m L。Kumar等[36]建立了快速檢測水產品中副溶血弧菌的ELISA方法。吳曉春等[37]以魚腸道弧菌為抗原制備多克隆抗體，用ELISA法來檢測對海水魚造成危害的弧菌屬致病菌，靈敏度可達到每孔105CFU/m L。

3.3.2 免疫層析技術

傳統(tǒng)ELISA技術操作繁瑣、耗時長，限制了其在養(yǎng)殖場現(xiàn)場檢測中的應用。目前，研究工作者將免疫層析技術應用于快速檢測，如側向層析技術(lateral-flow technology，LFT)被用于快速檢測試紙條的研發(fā)。與傳統(tǒng)檢測方法相比，該檢測技術具有快速、簡便、價格低廉等優(yōu)點。LFT的原理與ELISA相似，以固定了捕獲蛋白(通常為抗體或抗原)的硝酸纖維素膜作為基板，采用乳膠、膠體金、碳以及新型材料(上轉磷光或量子點)作為標記物對抗體或抗原進行標記，其檢測結果可以用肉眼直接觀測。目前已商業(yè)化用于診斷的免疫層析試紙產品大多為以納米級膠體金顆粒為標記材料。此技術操作簡便，一般5～15min就可得到結果，已廣泛用于藥殘檢測、食品安全、臨床診斷中，也有用于水產養(yǎng)殖品種病害檢測的報道。Sithigorngul等[38]制備了抗哈維氏弧菌的鼠單克隆抗體和羊多克隆抗體，將這兩種抗體用于膠體金免疫層析試紙條的制備，結果表明樣品檢測量只需100μL，針對哈維氏弧菌的檢測限可達106CFU/m L以上，而檢測時間小于15m in。秦璞等[39]利用膠體金免疫層析技術研制了一種快速檢測遲鈍愛德華氏菌的試紙條，該試紙條對遲鈍愛德華氏菌有良好特異性，5～10m in就可以得到檢測結果，敏感度達到105CFU/m L。

近年來，出現(xiàn)了基于新型材料和免疫層析技術，如目前報道較多的有量子點（quantum dots，QDs）、上轉磷光（up-converting phosphor，UCP）、納米磁珠、熒光微球等標記抗體的免疫層析。其中量子點與抗體偶聯(lián)后用于免疫層析顯示出良好的穩(wěn)定性和熒光強度，在人類病原菌檢測上已經有所應用。Tully等[40]初步建立了一種以量子點標記抗體檢測李斯特單增桿菌（Listeria monocytogenes）表面蛋白InlB，檢測限可以達到12 ng/m L。上轉磷光材料則因其背景干擾小、靈敏度高等特點，被應用于耶爾森氏菌和布魯氏菌[41，42]的檢測中，其靈敏度是膠體金免疫層析技術的10倍。目前，以上新型材料還未見用于魚類病原菌檢測的報道，但這些材料在未來檢測試紙條研制中顯示出良好的應用前景。

3.4 芯片技術

隨著近年來生物芯片技術的發(fā)展，以及病害檢測對大規(guī)模、高通量的要求，芯片技術越來越多被用到病原菌的檢測中。其中，應用最多的是基因芯片和蛋白芯片技術?；蛐酒夹g可以高通量、平行化對多種靶基因進行準確鑒定，為菌種鑒定提供了技術平臺。Panicker等[43]也通過多重PCR與DNA芯片相結合建立了一種主要針對創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌和副溶血弧菌檢測沿海水域和甲殼類動物中的致病弧菌的方法，檢測靈敏度為102～103CFU/m L。

蛋白芯片又稱蛋白微陣列，蛋白芯片是將各蛋白有序排列固定在載體上，之后用特異性標記的抗體或抗原蛋白與微陣列作用，經過掃描后確定蛋白間是否有相互作用。與基因芯片相比，蛋白芯片的研究仍處于摸索階段。究其原因是由于蛋白質分子本身結構功能的復雜性與特殊性造成的。目前蛋白芯片用于水產養(yǎng)殖細菌性病害檢測的報道較少。

4 現(xiàn)有海水養(yǎng)殖細菌性病害檢測方法的利弊及發(fā)展方向

綜上所述，目前已報道多種海水養(yǎng)殖細菌性病害的檢測方法，這些方法各有優(yōu)缺點，相比較而言，基于細菌富集培養(yǎng)及生理生化指標檢測的方法耗時、費力、精度和可靠性有限；基于分子生物學技術的檢測方法雖然靈敏度高、特異性強、快速準確，能夠檢測出樣品中的微量核酸，但是需要特定儀器設備并由專業(yè)技術人員操作，無法應用于基層養(yǎng)殖單位；基于免疫學技術ELISA檢測方法操作流程耗時繁瑣，無法實現(xiàn)對樣品的實時檢測。目前廣泛采用的膠體金免疫層析技術雖然操作簡便、耗時短、不需要專業(yè)技術人員操作，可以用于基層養(yǎng)殖場現(xiàn)場檢測，但靈敏度不夠高，導致一些發(fā)病癥狀不明顯或特異的病害無法在感染初期檢出并采取有效措施；基因芯片可高通量并行檢測，人為操作的誤差小，然而也存在價格昂貴等缺點。蛋白芯片技術雖然有著高特異性、高通量的特點，然而蛋白質結構復雜，合成困難，且蛋白較DNA更脆弱，易變性失活從而影響其性質和功能。

如何選擇有效的水產病害檢測方法，應根據(jù)施用單位的情況而異。對于具有一定實驗室條件的水產品檢驗檢疫單位或大型養(yǎng)殖企業(yè)，可以采用分子生物學技術，輔助以生理生化檢測手段，實現(xiàn)常規(guī)樣品的檢測。對于大量樣品，則可采用芯片技術進行高通量檢測，用于病害預警或附加值較高的水產品食品安全檢測。由于芯片制備復雜且檢測設備成本較高，影響了該技術的推廣。開發(fā)低成本芯片制備技術同時降低檢測設備成本是今后的發(fā)展方向。針對基層養(yǎng)殖單位或個體養(yǎng)殖戶，免疫層析試紙條因其操作簡單快速，攜帶方便而顯示出極大的優(yōu)勢，但該技術靈敏度有限，無法實現(xiàn)病害感染早期診斷，限制了其在海水養(yǎng)殖細菌性病害檢測方面的進一步應用。制備具有更好親和力的單克隆抗體，采用新型抗體標記材料配合相應的便攜式熒光讀取器，不僅有助于免疫層析試紙條靈敏度的提高，還可以用于病害的半定量分析及多元化檢驗。目前已有研究人員研制出靈敏度是膠體金免疫層析試紙條10～100倍的免疫層析試紙條，雖然還處于實驗室階段，且生產成本還有待進一步降低，但相信未來此類產品將成為廣大養(yǎng)殖基層單位病害檢測的主流產品。

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