[摘要] 目的 研究Klotho基因多態(tài)性與中國漢族人群衰老的關系。 方法 在482例（<60歲236例，60歲246例）沈陽地區(qū)健康漢族人群，采用Snapshot（微測序） 的方法檢測Klotho基因標簽SNP（TagSNP）-rs571118位點和功能SNP位點rs9536314（F352V），rs9527025（C370S）的基因型，觀察Klotho基因多態(tài)性與衰老的關系。結果 證實在中國漢族人群F352V（rs9536314）為G純合子，C370S（rs9527025）為T純合子；rs571118位點存在AA，GG，AG基因型。老年人群基因型分布為（AA35（14.22），AG132（53.65），GG79（32.11）），年輕人群基因型分布為（AA51（21.61），AG128（54.23），GG57（24.15））。Klotho基因rs571118位點G等位基因頻率在老年人群高于年輕人群。結論 Klotho基因rs571118位點多態(tài)性與衰老存在明顯相關。

[關鍵詞] 衰老；Klotho基因；單核苷酸多態(tài)性

[中圖分類號] R394 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）10-09-03

遺傳因素在衰老中起到重要作用[1]，而基因是遺傳信息的載體和遺傳物質的最小功能單位。衰老學家們認為，衰老并非單一基因決定，而是一連串基因激活和阻抑及各自產(chǎn)物相互作用的結果。內、外環(huán)境，如氧自由基等損傷因素都可以影響DNA（特別是線粒體DNA）的穩(wěn)定性，加速衰老進程。衰老時人體機能下降，對疾病的易感性增強。而基因多態(tài)性位點的變化，可能影響基因的表達水平，進而影響蛋白質的功能。弄清衰老基因的功能、調控、影響因素可能是弄清衰老機制的一條重要途徑。Klotho是一種抗衰老基因。Klotho作為一種輔助因子/復合受體調節(jié)成纖維細胞生長因子（FGF）23信號，影響細胞內信號通路包括p53/p21，cAMP，蛋白激酶C（PKC）和Wnt信號通路。Klotho保護內皮的機能障礙和調節(jié)一氧化氮的產(chǎn)生，Klotho基因表達增加，能通過

抑制胰島素信號和氧化應激進而抑制衰老和延長壽命[2]。人類Klotho基因的多態(tài)性相關于多種衰老相關疾病和紊亂的易感性增加。在1187白種人的研究中發(fā)現(xiàn)，在啟動子區(qū)域（G-395A）和一個外顯子4（C1818T，）的單倍型和老年絕經(jīng)后婦女的骨質密度顯著相關[3]，在韓國的研究發(fā)現(xiàn)，年齡差異影響Klotho G-395A和C1818T多態(tài)性與CAD的關聯(lián)性[4]。本研究對Klotho基因基因多態(tài)性與沈陽地區(qū)中國健康漢族人群衰老的的關系進行了研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年10月～2009年5月志愿者，男669例和女684例，經(jīng)過查體，詢問病史、血尿常規(guī)、血生化、胸片、腹部超聲、心血管超聲、肺功能的檢查，篩查出482例“健康”志愿者，均為沈陽市漢族居民，其中男228例，女254例，年齡35～91歲。

1.2 主要儀器和試劑

-80℃冰箱（SANYO Japan）；高速低溫離心機（Sigma USA）；ABI 3730xl DNA測序儀（ABI USA）；凝膠自動成像及分析系統(tǒng)Chemi Imager 5500（Alpha Innotech USA）。

1.3 方法

1.3.1 血標本采集 所有研究對象抽取清晨空腹外周靜脈血3 mL，2000 rpm離心15 min，棄上清，取血凝塊儲存于-80℃冰箱內備用。

1.3.2 基因組DNA的提取 取血凝塊，使用天根RelaxGene Blood DNA System血液基因組DNA提取系統(tǒng)提取基因DNA，按試劑盒說明操作。

1.3.3 Klotho基因SNP位點的選取 在Hapmap數(shù)據(jù)庫中下載Klotho基因的中國漢族人群的SNP基因型和等位基因數(shù)據(jù)，用Haploview軟件進行分析選擇tagSNP rs571118位點和兩個功能SNP位點rs9536314（F352V），rs9527025（C370S）。選定SNP位點后，首先用30個DNA樣品進行基因型分析，SNP位點雜合度大于5%則進行大樣本的基因型鑒定。

1.3.4 Snapshot檢測及測序 使用Snapshot（ABI）試劑盒進行單堿基延伸反應。反應體系：3μL Snapshot mix；2μL延伸引物以；l μL純化的PCR產(chǎn)物。循環(huán)參數(shù)：96℃預變性1 min，96℃變性10 s，52℃退火5 s，60℃延伸30 s，共28個循環(huán)。微測序產(chǎn)物中加入1U SAP，37℃孵育60 min，75℃再孵育15 min，進行純化處理，去除多余的引物和ddNTP。

每份樣品加入甲酰胺9μL，0.25μL內標Lizl20（ABI）和純化的微測序產(chǎn)物 1μL，95℃變性5 min后迅速放在冰上淬火2 min，在ABI的PRISMR3730xl DNA測序儀上進行毛細管電泳，運行GeneMarker V1.6分析軟件分析實驗結果。

2 結果

30個DNA樣品分型后后發(fā)現(xiàn)兩個功能SNP位點rs9536314（F352V），rs9527025（C370S）為純合子。放棄進一步擴大樣本進行檢測，而rs571118位點存在存在AA，GG，AG基因型。

Klotho基因的rs571118位點衰老與對照組的基因型及基因頻率相比較，見表1。衰老組的各個基因型與年輕組相比存在差異（x2=4.48，P=0.034<0.05）；等位基因頻率在兩組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（x2=5.73，P=0.016，OR=1.364，95%CI：1.058～1.760）。

3 討論

Klotho基因（MIM：604824）位于染色體13q12，包含5個外顯子，跨越近50 kb的基因組DNA，是一個衰老抑制基因[5]。過表達Klotho小鼠壽命延長；當敲除Klotho后，小鼠（klotho-/-）表現(xiàn)出諸多衰老相關的表型，如壽命縮短、不育、動脈粥樣硬化、皮膚萎縮、肺氣腫、步態(tài)障礙、異位鈣化、骨質減少/骨質疏松癥、肺氣腫、腦垂體異常和異常的鈣代謝[6]。在人群為基礎的相關性研究中，Klotho基因也相關于一些衰老的表型如骨質減少/骨質疏松，動脈硬化和鈣異常[2]。意大利的Chianti研究發(fā)現(xiàn)Klotho濃度是社區(qū)居住的老年人死亡率的獨立預測因子[7]。Klotho基因和衰老相關通路insulin/IGF-1信號通路相關，它可能通過對于氧化應激的抵抗而實現(xiàn)延遲衰老的功能[8]。Klotho作為一個輔因子增加Klotho纖維母細胞生長因子（FGFR）復合體結合到FGF23的結合力[9]。

Klotho基因的以KL-VS（F352V（rs9536314）和（C370S（rs9527025））位點為代表性的一些SNP位點受到廣泛研究。在意大利中北部，對總共1089名（669名女性和420名男性）從19～109歲無血緣關系的個體進行的研究，將研究對象劃分為3個年齡段-年輕組、老年組和百歲老人組。比較Klotho基因KL-VS等位基因頻率，Klotho的雜合子基因型在老人與青年對照組相比有顯著的增加，而百歲老人和青年組之間無明顯差異[10]。在英國982名白種健康女性的研究發(fā)現(xiàn)Klotho基因的4個SNP位點-395 G–A，1110 G–A，1818 C–T，2298 C–T和白細胞端粒長度不相關[11]。在韓國的的心血管病患者中觀察Klotho G-395A 和C1818T不同的多態(tài)表型對衰老的影響。同一位點在不同研究的結果不同也說明了人種和種族的差別對于基因頻率有較大影響。

為了探討Klotho基因多態(tài)性在衰老中所起到的潛在的作用，排除一些干擾因素如腫瘤，一些衰老相關的疾病和其他疾病的影響。在本研究中我們應用tagSNP策略選擇了Klotho基因的tagSNP位點rs571118進行研究，發(fā)現(xiàn)Klotho基因rs571118位點G等位基因頻率在老年人群高于年輕人群。本研究提示Klotho基因rs571118位點可能和中國沈陽地區(qū)漢族健康人群的衰老相關聯(lián)。

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（收稿日期：2013-03-14）