[摘要]目的：通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)，研究丙泊酚在大鼠腦缺血再灌注損傷時(shí)對(duì)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔活性的影響程度，及其抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡壞死的作用機(jī)制。以探討其在正頜外科控制性降壓中的腦保護(hù)作用機(jī)理。方法：選取健康雄性大鼠30只，體重250～300g，采用“雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷法”建立前腦缺血再灌注模型，左側(cè)側(cè)腦室于假手術(shù)組（C組）、缺血再灌注組（I/R）組注射生理鹽水1ml/kg，丙泊酚干預(yù)組（P組）射注丙泊酚1mg/kg，24h后斷頭提取海馬組織線粒體，加入CaCl2于37℃下形成鈣超載后孵育5min。電鏡觀察其微觀組織形態(tài)學(xué)改變，采用紫外分光光度計(jì)法來(lái)觀察線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放程度。結(jié)果：電鏡下C組線粒體結(jié)構(gòu)完整，排列密集；I/R組可見線粒體明顯腫脹、嵴斷裂、膜破裂；P組可見線粒體部分腫脹，嵴部分?jǐn)嗔?，但損傷程度輕于I/R組。與C組相比較，I/R組和P組線粒體吸光度值明顯下降（P<0.05）；與I/R相比，P吸光度值下降幅度減?。≒<0.05）。丙泊酚組細(xì)胞腫脹壞死明顯減輕，凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞明顯減少。結(jié)論：丙泊酚能夠改善大鼠前腦缺血再灌注后線粒體形態(tài)，其機(jī)制可能與其抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開放有關(guān)，從而改善線粒體功能，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡壞死，減輕腦缺血再灌注損傷。這說(shuō)明丙泊酚在正頜外科控制性降壓中使用時(shí)對(duì)大腦有良好的保護(hù)作用，可以大幅度提高手術(shù)安全效果，具有重要的臨床指導(dǎo)意義。

[關(guān)鍵詞]丙泊酚；腦缺血/再灌注；線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔

[中圖分類號(hào)]R971+.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2013）10-1072-04

腦缺血再灌注所造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷是各種腦血管疾病所帶來(lái)的主要病例生理改變。腦缺血/再灌注后神經(jīng)細(xì)胞能量代謝失衡，鈣超載和自由基生成會(huì)導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（Mitochondrial Permeability Transition Pore， MPTP）的開放，引起線粒體功能障礙，最終促使神經(jīng)細(xì)胞死亡和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[1]。丙泊酚能夠抑制大鼠腦缺血再灌注后氧自由基生成和鈣超載，從而發(fā)揮對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[2]。本實(shí)驗(yàn)擬觀察丙泊酚對(duì)大鼠前腦缺血再灌注后MPTP的影響，進(jìn)一步探討丙泊酚在正頜外科控制性降壓中使用時(shí)腦保護(hù)的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象：健康雄性Wistar大鼠30只，體重250～300g，隨機(jī)分為3組（n=10）。假手術(shù)組（C）：暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈后，左側(cè)腦室注射生理鹽水1mg/kg；缺血再灌注組（I/R）：腦缺血后左側(cè)腦室注射生理鹽水1mg/kg；異丙酚干預(yù)組（P）：腦缺血后左側(cè)腦室注射異丙酚1mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 采用“雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷法”建立前腦缺血再灌注模型。4%水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉后，行大鼠股動(dòng)脈穿刺，置管，監(jiān)測(cè)大鼠平均動(dòng)脈壓。放血降壓至平均動(dòng)脈壓為（40±5）mmHg時(shí)，頸正中切口，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，夾閉雙側(cè)勁總動(dòng)脈10min后放開動(dòng)脈夾形成再灌注。分別于缺血前，缺血后，再灌注后以及動(dòng)物復(fù)蘇后各時(shí)間點(diǎn)測(cè)量動(dòng)脈血?dú)狻?/p>

1.2.2 將大鼠麻醉后，迅速固定于腦立體定位儀上，頭皮正中切口，全部采用左側(cè)側(cè)腦室注射，于前囟后1mm，向左側(cè)1.2～1.5mm處，微量注射器沿此定位孔插入3.5～4.0mm，回吸腦脊液通暢，將生理鹽水或丙泊酚注射到側(cè)腦室中，消毒縫合切口。

1.2.3 每組10只大鼠于再灌注24h后斷頭，冰臺(tái)上迅速分離兩側(cè)海馬組織，PBS緩沖液沖洗，勻漿后置于分離緩沖液中。線粒體的提取依Pierce試劑盒（Phermo公司，美國(guó)）說(shuō)明進(jìn)行。將線粒體重懸于1ml重懸液中，取適量測(cè)蛋白含量，線粒體的含量以所含蛋白量表示，依BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定。取各組海馬組織的C1區(qū)固定于含0.1 mol/L二甲砷酸鹽緩沖液的4%戊二醛（pH 7.4）和1%的四氧化鋨中固定。經(jīng)乙醇梯度脫水后，包埋于Epon 812 環(huán)氧樹脂中，80 nm 超薄切片，以醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛染色，透射電子顯微鏡觀察海馬組織C1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的改變。紫外分光光度計(jì)法測(cè)定MPTP的開放狀態(tài)。

1.2.4 將提取后的各組線粒體即刻置于300mmol/L蔗糖，10mmol/L Tris·HCl的重懸液中充分混勻。各組加入200μmol/L的CaCl2。整個(gè)反應(yīng)體積為2ml，反應(yīng)溫度為37℃，即刻測(cè)定540 nm波長(zhǎng)下5 min 內(nèi)各組線粒體吸光度值的變化。以吸光度值的變化表示MPTP的開放程度，從而反應(yīng)MPTP的活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間及組內(nèi)比較均用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生理指標(biāo)：動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)的血?dú)夥治鼋Y(jié)果，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），因此，能夠排除血?dú)庖蛩貙?duì)本實(shí)驗(yàn)的影響，見表1。C組大鼠腦電圖形態(tài)為短至長(zhǎng)程8～10Hz、20～120μV的α節(jié)律和低電壓β波，間有單個(gè)θ波，見圖1；I/R組大鼠腦電圖形態(tài)為波幅較低的持續(xù)性7Hz、30～40μV的θ節(jié)律，見圖2，證實(shí)大鼠腦缺血模型成功。

2.2 線粒體形態(tài)學(xué)改變：C組可見線粒體內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)嵴清晰，排列密集；I/R組可見線粒體顯著腫脹，嵴呈絮狀，斷裂，排列錯(cuò)亂，基質(zhì)電子密度低；P組可見線粒體部分腫脹，嵴部分?jǐn)嗔?，損傷程度介于C組和I/R組之間，見圖3～5。

2.3 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔活性：表2所示在加入CaCl2后，三組的線粒體吸光度下降值。與C組相比，I/R組和P組吸光度值均下降（P<0.05），其中， I/R組的吸光度值下降最顯著（P<0.05）。

3 討論

線粒體是細(xì)胞能量代謝的中心，腦缺血再灌注時(shí)，自由基損傷是引起腦缺血再灌注損傷極為重要的環(huán)節(jié)[3]，自由基是具有不配對(duì)電子的原子或原子團(tuán)的總稱。自由基一旦產(chǎn)生過(guò)量就可引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的過(guò)氧化反應(yīng)，使膜結(jié)構(gòu)遭到破壞、蛋白質(zhì)降解、核酸鏈斷裂、細(xì)胞崩解、線粒體變性，從而導(dǎo)致細(xì)胞的不可逆性改變，最終死亡。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度的變化，也是諸多生理和病理變化的重要中介因素。腦缺血缺氧時(shí)，由于ATP供應(yīng)不足，大量興奮性氨基酸受體過(guò)度興奮介導(dǎo)與其偶聯(lián)的鈣通道開放、膜通透性增大及封阻機(jī)制障礙而致細(xì)胞外鈣內(nèi)流增加、造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高。而細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，一方面使血管收縮、進(jìn)一步加重腦缺血缺氧；同時(shí)引起細(xì)胞代謝紊亂、結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常改變，導(dǎo)致線粒體膜間隙腫脹，通透性降低，線粒體吸光度值下降及形態(tài)發(fā)生改變；線粒體受到嚴(yán)重破壞，能量生成障礙，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔發(fā)生變化，引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4]。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注（I/R）組神經(jīng)細(xì)胞線粒體腫脹甚至破裂，基質(zhì)大量破壞，證明缺血再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致線粒體形態(tài)發(fā)生改變。線粒體內(nèi)鈣離子聚集引起線粒體膜電位消失，而線粒體膜電位同線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）密切相關(guān)[5]。MPTP是位于線粒體內(nèi)外膜之間，非選擇性的多蛋白復(fù)合體，由電壓依賴型的陰離子通道、腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、親環(huán)蛋白D和其它蛋白組成[6]。缺血再灌注時(shí)，氧自由基和鈣超載會(huì)誘發(fā)MPTP開放，促使線粒體內(nèi)前凋亡因子細(xì)胞色素C等釋放到胞漿中，激活依賴caspase及非依賴caspase凋亡途徑，引起神經(jīng)元凋亡[7]。同時(shí)促使大量離子非選擇性進(jìn)入線粒體，造成線粒體膜電位喪失，線粒體腫脹[8]。我們通過(guò)對(duì)鈣離子誘發(fā)缺血后線粒體損傷研究發(fā)現(xiàn)，I/R組線粒體在540nm下的吸光度值明顯下降，表明鈣離子誘導(dǎo)MPTP開放，促使線粒體通透性增高。

丙泊酚能夠抑制腦缺血再灌注后的鈣超載和自由基生成，發(fā)揮腦保護(hù)作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚具有抗自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的作用。丙泊酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)為2，6-二異丙基苯酚，是一種含有酚環(huán)結(jié)構(gòu)的脂溶性化合物，與已知的抗氧化劑2，6-二叔丁基對(duì)甲酚和內(nèi)源性抗氧化劑維生素E在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有類似之處。在自由基反應(yīng)體系中，酚結(jié)構(gòu)可以提供一個(gè)氫原子，自身轉(zhuǎn)變成為苯氧基團(tuán)，其中芳香環(huán)的共軛效應(yīng)使得苯氧基團(tuán)活性降低，不能激發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)發(fā)生，而過(guò)多的自由基對(duì)機(jī)體的損傷主要是由脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)造成的。丙泊酚可以直接與氧自由基反應(yīng)，生成穩(wěn)定的2，6-二異丙基苯氧基團(tuán)，即以低活性的自由基取代了高活性的自由基，減輕了后者引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。賈東林等[10]在大鼠腦皮質(zhì)線粒體自由基損傷模型中，發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化反應(yīng)可降低線粒體膜流動(dòng)性、增加線粒體腫脹和丙二醛含量，而預(yù)先給予丙泊酚30μmol/L體外溫育則可減輕上述損傷。本研究通過(guò)電子顯微鏡觀察經(jīng)丙泊酚干預(yù)后的神經(jīng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其線粒體形態(tài)保持較好，這證明了丙泊酚能夠維持線粒體膜電位水平，并減輕線粒體腫脹，改善線粒體功能。丙泊酚發(fā)揮腦保護(hù)作用的另一機(jī)制可能是抑制細(xì)胞內(nèi)的鈣超載。目前認(rèn)為鈣介導(dǎo)的毒性作用是腦細(xì)胞死亡的重要因素。各種原因引起的細(xì)胞內(nèi)鈣超載是啟動(dòng)一系列病理生理機(jī)制導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡和凋亡的最后共同通路。細(xì)胞內(nèi)鈣濃度往往和腦損傷時(shí)細(xì)胞受損程度呈正相關(guān)。丙泊酚可在一定程度上增加L型電壓依賴性鈣通道的電流失活率，從而減少鈣內(nèi)流。丙泊酚還可通過(guò)抑制磷脂酶C的活性減少三磷酸肌醇的合成，降低了細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存鈣的釋放量，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載[11]。觀察丙泊酚對(duì)鈣誘導(dǎo)所致線粒體損傷的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙泊酚干預(yù)后線粒體吸光度值較缺血組下降緩慢，提示丙泊酚阻止鈣超載引起的MPTP孔道開放，維持線粒體膜電位穩(wěn)定，直接發(fā)揮輕度解偶聯(lián)的作用。

正頜外科控制性降壓是必須使用的一項(xiàng)麻醉技術(shù)，丙泊酚是術(shù)中常用的麻醉藥，由于丙泊酚有類似巴比妥類藥物的作用，包括減輕腦水腫，降低腦代謝率，減少神經(jīng)細(xì)胞能量消耗；此外丙泊酚還能減少興奮性氨基酸的產(chǎn)生，減少鈣內(nèi)流等。所以在正頜外科截骨降壓時(shí)丙泊酚對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用。在今后正頜外科麻醉中控制性降壓時(shí)可以大量使用，以發(fā)揮其腦保護(hù)的作用。

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[收稿日期]2013-04-09 [修回日期]2013-05-03

編輯/張惠娟