[摘要]目的：探討葛根素對(duì)人牙周膜干細(xì)胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）成骨分化的影響。方法：向體外培養(yǎng)的hPDLSCs中分別加入0.01mmol/L、0.1mmol/L和1mmol/L葛根素作為實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)陽性對(duì)照組和空白組。MTT法檢測(cè)葛根素對(duì)hPDLSCs活性影響，采用免疫熒光法、堿性磷酸酶（alkaline phosphotase，ALP）試劑盒、茜素紅染色及qRT-PCR對(duì)葛根素作用后hPDLSCs生物學(xué)特性作初步觀察。結(jié)果：0.01mmol/L葛根素可明顯促進(jìn)hPDLSCs增殖，免疫熒光染色顯示實(shí)驗(yàn)組I型膠原蛋白（collagen-I，COL-I）和骨橋蛋白（osteopontin，OPN）均陽性表達(dá)；與空白組對(duì)比，實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)7天后ALP活性升高，14天后茜素紅染色見礦化結(jié)節(jié)形成，qRT-PCR檢測(cè)ALP和骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）分別在加藥后7天和14天表達(dá)上調(diào)。結(jié)論：葛根素能夠促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。

[關(guān)鍵詞]牙周膜干細(xì)胞；葛根素；成骨分化

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2013）10-1067-05

眾所周知，雌激素缺乏會(huì)增加患牙周病的危險(xiǎn)度引起牙槽骨迅速吸收牙齒松動(dòng)[1]。葛根素是從豆科植物野葛的干燥根中提取的一種異黃酮類化合物，可作為雌激素的替代藥物發(fā)揮雌激素樣作用[2]。文獻(xiàn)報(bào)道葛根素能夠促進(jìn)臍帶間質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[3]。人牙周膜干細(xì)胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）具有多向分化潛能，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可分化為成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及神經(jīng)元樣細(xì)胞[4]。本研究旨在探討葛根素對(duì)hPDLSCs成骨分化的影響，為臨床牙槽骨再生的防治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料：葛根素（陜西天潤(rùn)生化有限公司，HPLC≥98%），二甲基亞砜、胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基、胰酶、Dispase酶、膠原酶（Gibco，美國(guó)），免疫磁珠、磁力架（Dynal biotech，美國(guó)），STRO-1單克隆抗體、CD146單抗、抗波形絲蛋白單抗、抗廣譜角蛋白單抗、抗骨橋蛋白單抗（Novex，美國(guó)），抗I型膠原蛋白單抗、山羊抗鼠熒光二抗（Abcam，美國(guó)），山羊抗兔熒光二抗（Jackson，美國(guó)），地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉、茜素紅、MTT（Sigma，美國(guó)），ALP試劑盒（南京建成），DNAase試劑盒（Promega，美國(guó)），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本），qPCR試劑盒（Roche，瑞士）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 hPDLSCs的分離和培養(yǎng)：在供者知情同意的前提下，收集12～16歲因正畸拔除的雙尖牙，所選牙齒均無齲壞、根尖周疾病及牙周炎。參考以往的文獻(xiàn)[5-6]，將新鮮拔除的牙齒在超凈工作臺(tái)內(nèi)沖洗干凈后，仔細(xì)刮取根中1/3的牙周膜組織，加入1ml 6mg/ml的膠原酶和1ml 8mg/ml的Dispase酶（此為四顆牙用量）混勻37℃水浴消化1h左右，1000rpm離心5min后棄上清，細(xì)胞重懸于10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待人牙周膜細(xì)胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）傳至第三代，采用免疫磁珠法分離hPDLSCs：將約1×106/ml的hPDLCs與STRO-1單抗4℃孵育1h，與磁珠4℃孵育30min，在磁力架作用下篩選出STRO-1+hPDLCs并接種于6 孔板內(nèi)，37℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 hPDLSCs的鑒定：將篩選出的STRO-1+hPDLCs制備成細(xì)胞爬片，免疫熒光法進(jìn)行STRO-1 、CD146、波形絲蛋白（Vimentin）及角蛋白（Cytokertin）染色，陰性對(duì)照以PBS代替一抗，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 MTT法檢測(cè)葛根素對(duì)hPDLSCs活性的影響：將hPDLSCs按1×103/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后分別更換為含0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L葛根素的α-MEM培養(yǎng)基（每孔200μl），每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不含葛根素的空白對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后， 各孔加入MTT 20μl，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，棄上清液， 每孔加入DMSO溶液150μl，混勻后用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在570 nm 處的吸光度值。

1.2.4 葛根素對(duì)hPDLSCs成骨分化的影響

1.2.4.1 免疫熒光染色：分別取實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)7天和14天的細(xì)胞制備爬片，免疫熒光法進(jìn)行成骨標(biāo)志COL-I及OPN染色，陰性對(duì)照以PBS代替一抗，未加葛根素組作為空白對(duì)照，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4.2 ALP活性測(cè)定：將hPDLSCs接種于24孔板，待70%～80%匯合后，實(shí)驗(yàn)組更換為含0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L葛根素培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)空白組（不含葛根素的α-MEM培養(yǎng)基）和陽性對(duì)照組（成骨誘導(dǎo)液：含10%FBS的α-MEM、100nmol/L的地塞米松、0.05mmol/L的抗壞血酸、10mmol/L的 β-甘油磷酸鈉[7]），繼續(xù)培養(yǎng)7天后（每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)基），按照ALP試劑盒說明書操作在酶標(biāo)儀520nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度并計(jì)算出ALP濃度。

1.2.4.3 礦化結(jié)節(jié)形成檢測(cè)：將hPDLSCs接種于6孔板，待70%～80%匯合后，同上設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、空白組、陽性對(duì)照組，培養(yǎng)14天后，棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛室溫固定15min，PBS（pH=4.2）沖洗2次，2%（w/v）茜素紅溶液在37℃孵育箱內(nèi)染色20min后PBS沖洗3次，鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況。

1.2.4.4 qRT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況：將hPDLSCs接種于12孔板，待70%～80%匯合后，實(shí)驗(yàn)組、空白組、陽性對(duì)照組更換相應(yīng)培養(yǎng)液，分別在培養(yǎng)7天和14天后收集細(xì)胞并以TRIzol提取總RNA，用DNAase處理后測(cè)其在波長(zhǎng)260nm和280nm處的吸光度比值，介于1.8～2.0純度的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。熒光定量PCR采用LightCycler480系統(tǒng)，步驟為：變性95℃ 60s，退火58℃ 30s，延伸72℃ 30s，共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。成骨相關(guān)基因引物及內(nèi)參基因GAPDH序列為：ALP引物序列：F：TTCAAACCGAGATACAAGCACT，R：GGGCCAGACCAA AGATAGAG；OCN引物序列：F：GCAGCCACCGAGACACCAT，R：AGAGCGACACCCTAGACCG；內(nèi)參基因GAPDH引物序列：F：AGGTCGGAGTCAACGGATTTG，R：AGGCTGTTGTCATAC TTCTCAT。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS16.0 軟件對(duì)組間進(jìn)行單因素方差分析，并比較各組間的差異，P<0.05即認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hPDLSCs分離和培養(yǎng)：本實(shí)驗(yàn)采用酶消化法從人牙周膜中分離出原代hPDLCs進(jìn)行培養(yǎng)，3～7天后見細(xì)胞爬出，呈梭形成纖維細(xì)胞狀，兩周左右可達(dá)80%匯合。用免疫磁珠法篩選出hPDLSCs，接種于24孔板，約兩周長(zhǎng)滿孔底80%。hPDLSCs形態(tài)與hPDLCs相似，為梭形、多角形或不規(guī)則形，呈旋渦狀或放射狀排列（圖1A）。篩選前后分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示STRO-1+細(xì)胞約占細(xì)胞總數(shù)的2%。

2.2 hPDLSCs鑒定：免疫熒光法檢測(cè)示篩選出的細(xì)胞STRO-1、CD146 均呈陽性表達(dá)（圖1B、C），提示其具有干細(xì)胞特性。Cytokertin呈陰性表達(dá)，Vimentin呈陽性表達(dá)（圖1D），說明篩選出的細(xì)胞為中胚層來源的間充質(zhì)細(xì)胞，無外胚層來源的細(xì)胞污染。

2.3 葛根素對(duì)hPDLSCs增殖影響：MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，hPDLSCs在0.01mmol/L、0.1mmol/L和1mmol/L葛根素作用24h后，各實(shí)驗(yàn)組OD值均大于空白組，且0.01mmol/L組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。提示0.01mmol/L葛根素有促進(jìn)hPDLSCs增殖作用，而其他兩濃度組對(duì)細(xì)胞未產(chǎn)生毒性作用。

2.4 葛根素對(duì)hPDLSCs成骨分化的影響

2.4.1 免疫熒光染色：將實(shí)驗(yàn)組hPDLSCs進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示成骨表面標(biāo)志COL-I和OPN分別在葛根素作用7天和14天后呈陽性表達(dá)（圖3A、B），空白組及PBS陰性對(duì)照組呈陰性表達(dá)，提示葛根素可使hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化。

2.4.2 ALP活性：如圖4示，與空白組相比，葛根素各濃度組在加藥7天后細(xì)胞內(nèi)ALP水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與陽性對(duì)照組相比差異不顯著，提示葛根素可促進(jìn)hPDLSCs成骨分化。

2.4.3 礦化結(jié)節(jié)形成：各組細(xì)胞培養(yǎng)14天后進(jìn)行茜素紅染色，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組均見大量礦化結(jié)節(jié)形成，其中0.1mmol/L葛根素組與陽性對(duì)照組的礦化結(jié)節(jié)大小及數(shù)量相當(dāng)，但0.01mmol/L和1mmol/L葛根素組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)少于陽性對(duì)照組（圖3C～G）。

2.4.4 RT-PCR：RT-PCR分別檢測(cè)早期和晚期成骨相關(guān)基因ALP和OCN。ALP表達(dá)變化為：在加藥第7天時(shí)各濃度葛根素組和陽性對(duì)照組均呈上調(diào)趨勢(shì)，其中0.1mmol/L組上調(diào)顯著，為空白對(duì)照組的4.8倍；在加藥第14天時(shí)各濃度葛根素組的ALP表達(dá)量與空白對(duì)照組相比未見明顯變化。OCN表達(dá)變化為：在加藥第7天時(shí)各組OCN表達(dá)量沒有明顯變化；在加藥第14天時(shí)各濃度葛根素組和陽性對(duì)照組OCN表達(dá)量均顯著上調(diào)，其中0.1mmol/L組上調(diào)最為顯著，為空白對(duì)照組的5.6倍（圖5）。

3 討論

牙周膜干細(xì)胞是牙周組織中的成體干細(xì)胞，自從2004年Seo[6]成功地將其分離出來，它便以多向分化潛能及牙周高相關(guān)性成為牙周組織工程理想的種子細(xì)胞，近幾年來已成為牙周再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題[8]。研究表明PDLSCs上表達(dá)雌激素受體（ER-α、ER-β），且受雌激素的調(diào)控[9]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ER-β是雌激素調(diào)控牙周膜細(xì)胞增殖與成骨分化的主要受體[10]。ZhangB等從反面證明卵巢切除大鼠牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力受損[11]。

雌激素替代療法被認(rèn)為是一種有效的防治骨質(zhì)疏松促進(jìn)骨形成的方法，但是長(zhǎng)期使用雌激素會(huì)極大地提高乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等的發(fā)病率[12]。而植物類雌激素能夠有效地彌補(bǔ)了這一缺陷，如黃酮類中草藥淫羊藿苷在一定濃度范圍內(nèi)可促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞增殖及骨向分化[13]。同屬黃酮類的藥物葛根素亦能夠發(fā)揮雌激素樣作用即促進(jìn)骨密度增加和骨礦沉積[14]。近年來，國(guó)內(nèi)越來越多的學(xué)者開始探索葛根素在骨代謝方面的作用。蔡花[3]等研究表明葛根素對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨分化有促進(jìn)作用；李斌斌[15]等將葛根素分別作用于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞發(fā)現(xiàn)葛根素通過抑制骨吸收刺激骨形成來調(diào)控骨代謝，其中抑制骨吸收的效果較強(qiáng)；金為旭[16]將葛根素注射于拔牙窩周圍發(fā)現(xiàn)其能夠抑制剩余牙槽嵴的吸收并保存牙槽嵴的高度。但關(guān)于葛根素對(duì)hPDLSCs成骨分化的調(diào)控作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用免疫磁珠法成功地分離出hPDLSCs，并通過免疫熒光染色檢測(cè)證實(shí)其表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物STRO-1和CD146。當(dāng)加入不同濃度的葛根素時(shí)，MTT結(jié)果顯示隨著濃度的增高細(xì)胞增殖率遞減，0.01mmol/L組明顯促進(jìn)hPDLSCs的增殖，而其他兩組與空白組無顯著差異，以往的研究已發(fā)現(xiàn)葛根素在低濃度時(shí)促進(jìn)而超過1.2mmol/L即開始抑制細(xì)胞增殖[2-3]，本實(shí)驗(yàn)所選三個(gè)濃度均未對(duì)hPDLSCs造成毒性作用。含有β-甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松的成骨誘導(dǎo)液是間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化所必需[7]，可誘導(dǎo)hPDLSCs分化為成骨細(xì)胞，這一過程大致分為兩個(gè)階段，即基質(zhì)成熟（成骨早期）和礦化完成（成骨晚期）。分化早期伴隨著PDLSCs增殖減弱，基質(zhì)成熟的標(biāo)志物--ALP逐漸增高，到了晚期基質(zhì)開始礦化，OCN表達(dá)升高，礦化結(jié)節(jié)大量形成，如果早期細(xì)胞過度增殖則無法順利進(jìn)入下一階段[17]。本實(shí)驗(yàn)以成骨誘導(dǎo)液作為陽性對(duì)照，觀察葛根素對(duì)PDLSCs成骨分化的作用。加藥作用7天后，ALP活性升高， RT-PCR檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)早期ALP表達(dá)顯著上調(diào)。加藥作用14天后，與空白組對(duì)比，OCN表達(dá)明顯上調(diào)，茜素紅染色亦可見大量礦化結(jié)節(jié)形成。免疫熒光染色檢測(cè)顯示成骨表面標(biāo)志COL-I及OPN均陽性表達(dá)。對(duì)比分析本次實(shí)驗(yàn)組的三個(gè)濃度，0.1mmol/L葛根素組成骨表現(xiàn)強(qiáng)于其他兩濃度組，分析可能是因?yàn)?.01mmol/L的葛根素明顯促進(jìn)hPDLSCs的增殖阻礙其向下一階段即成骨分化發(fā)展，而1mmol/L的葛根素對(duì)hPDLSCs的增殖和分化均產(chǎn)生了輕微的抑制作用，但具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

本研究首次表明：在適當(dāng)?shù)臐舛茸饔孟?，葛根素可有效地促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化，為其應(yīng)用于口腔臨床防治牙槽骨吸收提供了理論基礎(chǔ)。

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[收稿日期]2013-04-13 [修回日期]2013-05-10

編輯/張惠娟