摘要：目的：探究雌激素α受體基因多態(tài)性對原發(fā)性膽汁性肝硬化Th1 、Th2類細胞因子表達的影響，為臨床診斷治療提供依據(jù)。方法：選擇本院34名原發(fā)性膽汁性肝硬化患者為研究對象，檢測每位患者雌激素α受體基因以及th1 th2類細胞因子表達情況，并與正常人結果進行對比分析，為臨床診斷治療提供依據(jù)。結果：肝嚴重損害的患者的IL- 4、 IL- 10含量與肝輕度損害患者的無明顯差異，無統(tǒng)計學意義（P>0.05）其含量與r谷氨酰轉(zhuǎn)移酶以及堿性磷酸酶（GGT和ALP）呈正相關；而肝嚴重損害的患者IL- 2 和TNF- a的含量明顯高于肝輕度損害患者，有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其含量與GGT和ALP呈負相關。雌激素α受體基因中的Pp基因是肝硬化發(fā)病的易感基因，Xbal和PvuII基因的多態(tài)性會增加雌激素受體的轉(zhuǎn)錄翻譯，增加雌激素受體的含量。此外，ERα基因多態(tài)性可作為遺傳易感背景影響PBC患者體內(nèi)T細胞亞群的偏移及其相關細胞因子的表達。結論：雌激素α受體基因的多樣性表達Th1 、Th2類細胞因子的含量不同，Th1 類細胞因子介導了對肝臟細胞的破壞作用， 而Th2 型細胞因子則具有一定的保護性作用。雌激素α受體基因中的Pp基因是肝硬化發(fā)病的易感基因，同時，雌激素受體基因的多態(tài)性會增加肝硬化發(fā)生的機率，也會影響PBC患者體內(nèi)T細胞亞群的偏移及其相關細胞因子的表達。

關鍵詞：雌激素α受體基因多態(tài)性；原發(fā)性膽汁性肝硬化；th1 th2類細胞因子

中圖分類號：R575.2 文獻標識碼：A 文章編號：1005-0515（2013）9-002-02

原發(fā)性膽汁性肝硬化（ PBC） 是一種自身免疫疾病。該病的臨床表現(xiàn)主要是長期梗阻性黃疸、因膽汁刺激引起的皮膚瘙癢以及肝大等癥狀，可伴有高脂血癥以及黃色素瘤[1]。肝內(nèi)小葉間膽管上皮可發(fā)生空泡性變性壞死，有膽汁淤積和淋巴細胞浸潤，纖維組織進而增生分割小葉，最終導致肝硬化、肝功能衰竭。本次研究通過34名原發(fā)性膽汁性肝硬化患者的臨床資料，來探究雌激素α受體基因多態(tài)性對原發(fā)性膽汁性肝硬化Th1 、Th2類細胞因子表達的影響，為臨床診斷治療提供依據(jù)。詳細報道如下：

1資料與方法

1.1 一般資料

選擇本院2009年至2012年在本院治療原發(fā)性膽汁性肝硬化的34名患者為研究對象，男5名，女29名，年齡35-65歲，平均年齡（54±3.2）歲，每位患者均符合原發(fā)性膽汁性肝硬化的診斷標準[2]，均未使用過糖皮質(zhì)激素類、免疫方面類以及熊去氧膽酸治療，同時每位患者均無肝內(nèi)占位病變以及其他惡性腫瘤消耗疾病，又根據(jù)肝功能異常的程度分類：肝功能嚴重損害組9名：r谷氨酰轉(zhuǎn)移酶以及堿性磷酸酶高于正常值的5倍；肝功能輕度損壞組11名：r谷氨酰轉(zhuǎn)移酶以及堿性磷酸酶低于正常值的5倍。緩解組14名：經(jīng)過正規(guī)治療后，肝功能指標均大致達到正常水平，其中，男1名，女13名，年齡為36-65歲，平均年齡為（53±4.7）歲。同時，選擇32名健康人為對照組，男4人，女28名，年齡為35-64歲，平均年齡（53±4.2）歲。

1.2 Th1、Th2類細胞因子mRNA表達的檢測

取每位研究人員的外周血，采取密度梯度離心法，分離單個核細胞，并置于完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，在培養(yǎng)6小時和24小時后收集細胞，置于37°培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，采用異硫氰酸肌法提取細胞RNA，并應用分光計度計比色計量，將其培養(yǎng)液加入逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、RNasin以及相應的反應緩沖液，進行逆轉(zhuǎn)錄，1小時后加熱再迅速降溫，分離cDNA，放入冰箱內(nèi)備用。引物擴增應用細胞因子特異引物序列，在10ul的cDNA中加入dNTPs、引物、Taq酶、反應緩沖液，配成聚合酶鏈式反應（PCR）產(chǎn)物，進行瓊脂糖凝膠電泳，采取掃描成像分析，分別測出Th1、Th2類細胞因子的表達情況，認真記錄血清白細胞介素- 4（ IL-4） 、白細胞介素- 10 （ IL- 10） 、腫瘤壞死因子α （ TNF- a）以及白細胞介素- 2 （ IL- 2）的含量[3]。

提取到的RNA進行純度測定并定量，并根據(jù)表達Th1 、Th2類細胞因子的引物序列自行設計引物，詳細見表1

上述反應采取取5μlPCR產(chǎn)物與2μl Lodding Buffer混合，進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，100V 1.5小時，電泳結束后，凝膠成像儀成像分析，以來了解肝硬化病人RNA中Th1 、Th2類細胞因子的引物序列，為細胞因子的水平與肝功能損傷的關系提供依據(jù)。

1.3雌激素α受體基因多態(tài)性情況

采用焦磷酸測序技術檢測各位點，計算基因型和等位基因型頻率，測定的 5 個SNP 位點（ESR1：rs2234693、rs2228480、rs3798577；ESR2：rs1256030、rs1048315）分析正常人與肝硬化病人的雌激素基因有無明顯差別。通過實驗結果顯示：ESR2 rs1256030 各基因型分布無差異，T 等位基因患 PBC 的風險是 C 等位基因的 1.5 倍，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。ESR1 單倍型分析結果表明基因型 TGC 在病例組中出現(xiàn)頻率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而基因型 TAC 在病例組中出現(xiàn)頻率低于對照組，同時，基因型 TAT 在 GGT 異常組中出現(xiàn)頻率明顯高于GGT 正常組，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.01）。說明ESR2 單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性膽汁性肝硬化有關。ESR2 rs1256030 T 等位基因型可能是原發(fā)性膽汁性肝硬化的危險因素。此外，TAT 基因型則是PBC 患者肝功能的危險因素，TAC 基因型可能具有加重 PBC 患者膽汁淤積的功能。

1.4統(tǒng)計學方法

實驗結果應用采用SPSS 1.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料采用X±s的形式表示，數(shù)據(jù)結果分析應用t檢驗，計數(shù)資料之間采用卡方檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 細胞因子檢測

緩解組血清白細胞介素- 4（ IL-4） 、白細胞介素- 10 （ IL- 10）以及TNF- α的含量與對照組和未治療組比較，有明顯差異，有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但對照組與未治療組相比無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。未治療組的白細胞介素- 2 （ IL- 2）的含量與對照組和緩解組相比，有明顯差異，具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），且對照組與緩解組之間相比也有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

2.2 細胞因子的水平與肝功能損傷的關系

肝功能嚴重損傷未治療患者的血清中IL- 4、 IL- 10、TNF- a以及IL- 2 的數(shù)值分別是：28.75 ±3.52、49.02 ±7.56、181.43±93.56、174.26 ±11.36，而肝功能輕度損壞的患者血清IL- 4、 IL- 10、TNF- a以及IL- 2 的數(shù)值分別是：29.14 ±3.56、50.46 ±7.45、

123.14 ±0.426、63.21±24.27。肝嚴重損害的患者的IL- 4、 IL- 10含量與肝輕度損害患者的無明顯差異，無統(tǒng)計學意義（P>0.05）其含量與r谷氨酰轉(zhuǎn)移酶以及堿性磷酸酶（GGT和ALP）呈正相關；而肝嚴重損害的患者IL- 2 和TNF- a的含量明顯高于肝輕度損害患者，有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其含量與GGT和ALP呈負相關。

2.3雌激素α受體基因多態(tài)性與肝功能損傷的關系

雌激素α受體基因中的Pp基因是肝硬化發(fā)病的易感基因，攜帶p基因會導致乙肝患者轉(zhuǎn)化為肝硬化，導致肝功能損壞。P基因?qū)е麓萍に厥荏w功能減低以及表達減少，減弱了抗纖維化作用，導致肝硬化產(chǎn)生，影響肝功能。Xbal和PvuII基因的多態(tài)性會增加雌激素受體的轉(zhuǎn)錄翻譯，增加雌激素受體的含量。此外，有研究顯示：中國人群中ERα 基因T29C 位點多態(tài)性與HBV 持續(xù)感染顯著相關，進而影響肝功能。

2.4雌激素α受體基因多態(tài)性對原發(fā)性膽汁性肝硬化TH1TH2類細胞因子表達的影響

雌激素α受體基因的多態(tài)性造成較多的Th1細胞浸潤肝組織內(nèi)，同時分泌TH1細胞因子，本次研究結果外周血中以Th1細胞為主，而Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF等，本次研究結果顯示：肝嚴重損害的患者IL- 2 和TNF- a的含量明顯高于肝輕度損害患者，有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其含量與GGT和ALP呈負相關。ERα基因多態(tài)性可作為遺傳易感背景影響PBC患者體內(nèi)T細胞亞群的偏移及其相關細胞因子的表達。

3討論

原發(fā)性膽汁性肝硬化到目前為止還沒有明確的致病因素，一般認為該病主要和遺傳、環(huán)境以及感染有關，女、男性發(fā)病率之比接近9：1[4]，疾病高發(fā)階段主要是絕經(jīng)前后，該階段雌激素水平變化顯著，肝臟對雌激素滅火功能障礙，導致該病發(fā)生。雌激素受體的結構、功能以及表達水平均受雌激素受體基因的影響，而雌激素受體基因具有多樣性，進而影響雌激素的生物功能[5]。但雌激素的生物活性對原發(fā)性肝硬化的th1 th2類細胞因子的表達是否有影響尚不能明確。本次研究針對該問題，通過34名原發(fā)性膽汁性肝硬化患者的臨床資料，來探究雌激素α受體基因多態(tài)性對原發(fā)性膽汁性肝硬化Th1 、Th2類細胞因子表達的影響，為臨床診斷治療提供依據(jù)[6]。雌激素α受體基因的多態(tài)性表達Th1 、Th2類細胞因子的含量不同，導致對肝的影響也不同，造成外周血中Th1細胞含量較多，從而使得Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF等細胞因子含量升高。

結果顯示：肝嚴重損害的患者的IL- 4、 IL- 10含量與肝輕度損害患者的無明顯差異，無統(tǒng)計學意義（P>0.05）其含量與GGT和ALP呈正相關；而肝嚴重損害的患者IL- 2 和TNF- a的含量明顯高于肝輕度損害患者，有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其含量與GGT和ALP呈負相關。雌激素α受體基因中的Pp基因是肝硬化發(fā)病的易感基因，Xbal和PvuII基因的多態(tài)性會增加雌激素受體的轉(zhuǎn)錄翻譯，增加雌激素受體的含量。此外，ERα基因多態(tài)性可作為遺傳易感背景影響PBC患者體內(nèi)T細胞亞群的偏移及其相關細胞因子的表達。

綜上所述，雌激素α受體基因的多樣性表達Th1 、Th2類細胞因子的含量不同，導致對肝的影響也不同，Th1 類細胞因子介導了對肝臟細胞的破壞作用， 而Th2 型細胞因子則具有一定的保護性作用。雌激素α受體基因中的Pp基因是肝硬化發(fā)病的易感基因，同時，雌激素受體基因的多態(tài)性會增加肝硬化發(fā)生的機率，也會影響PBC患者體內(nèi)T細胞亞群的偏移及其相關細胞因子的表達。

參考文獻：

[1] Stojakovic T， Claudel T， Putz-Bankuti C， et al. Low-dose atorvastatin improves dyslipidemia and vascular function in patients with primary biliary cirrhosis after one year of treatment[J]. Atherosclerosis， 2010， 209（1）：178-183.

[2] Corpechot C， Chazouillères O， Poupon R. Early primary biliary cirrhosis： biochemical response to treatment and prediction of long-term outcome[J]. J Hepatol， 2011， 55（6）：1361-1367.

[3] Tsuda M， Moritoki Y， Lian ZX， et al. Biochemical and immunologic effects of rituximab in patients with primary biliary cirrhosis and an incomplete response to ursodeoxycholic acid[J]. Hepatology， 2012， 55（2）：512-521.

[4] Rabahi N， Chrétien Y， Gaouar F， et al. Triple therapy with ursodeoxycholic acid， budesonide and mycophenolate mofetil in patients with features of severe primary biliary cirrhosis not responding to ursodeoxycholic acid alone[J]. Gastroenterol Clin Biol， 2010， 34（4-5）：283-287.

[5] Takeuchi Y， Ikeda F， Fujioka SI， et al. Additive improvement induced by bezafibrate in patients with primary biliary cirrhosis showing refractory response to ursodeoxycholic acid[J]. J Gastroenterol Hepatol， 2011， 26（9）：1395-1401.

[6] Tandon P， Rowe BH， Vandermeer B， et al. The efficacy and safety of bile acid binding agents， opioid antagonists， or rifampin in the treatment of cholestasis-associated pruritus[J]. Am J Gastroenterol， 2007， 102（7）：1528-1536.