摘要：優(yōu)化酶法輔助提取紅旱蓮（Hypericum ascyron L.）中總黃酮的工藝。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究酶解溫度、pH、酶用量和酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響。結(jié)果表明，酶法提取紅旱蓮中總黃酮的最佳工藝條件為酶用量1.5%，酶解溫度35 ℃，酶解時(shí)間1.0 h，pH 5.2，總黃酮提取率可達(dá)13.26 mg/g，比直接超聲法提取提高了10.2%。

關(guān)鍵詞：紅旱蓮（Hypericum ascyron L.）；纖維素酶；總黃酮；提??；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：R284.2；S661.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）21-5285-03

Optimization for Extracting Total Flavonoids from Hypericum ascyron L. by Enzyme Assisted Method

FENG Hai-yan，REN Lei，LEI Ni，CHANG Yong-fang，YANG Jia-jia

（School of Chemical Engineering， Shijiazhuang University， Shijiazhuang 050035， China）

Abstract： The extracting process of the total flavonoids from Hypericum ascyron L. by enzyme assisted method was optimized. On the basis of single factor tests and orthogonal experiment， the effects of enzymatic treatment temperature， pH value， enzyme dosage， and enzymatic treatment time on the total flavonoids content were studied. The results showed that the optimal enzymatic extracting process of total flavonoids were enzyme dosage 1.5%， enzymatic temperature 35 ℃， enzymatic time 1.0 h， and pH value 5.2， and the total flavonoids content reached 13.26 mg/g， 10.2% more than that by ultrasonic extraction method.

Key words： Hypericum ascyron L.； cellulase； total flavonoids； extraction； orthogonal experiment

紅旱蓮系藤黃科（Guttiferae）金絲桃屬（Hypericum）植物黃海棠（Hypericum ascyron L.）的全草，主要分布在我國(guó)東北地區(qū)，黃河、長(zhǎng)江及珠江流域，性寒，味微苦，具有涼血止血、清熱解毒的功效，民間用于止血，治療黃疸、肝炎等病癥[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，該植物富含蘆丁、槲皮素、金絲桃苷等黃酮類物質(zhì)，還可用于抗抑郁癥、抗病毒、抗癌等[2，3]。中藥活性成分的含量與提取工藝有很大關(guān)系。已有研究將乙醇熱回流法[4，5]和超聲波法[6]用于紅旱蓮總黃酮的提取。酶法提取是近年來(lái)應(yīng)用較廣泛的一種植物有效成分提取新技術(shù)，具有反應(yīng)特異性高、條件溫和、易于控制、能保持生物活性等優(yōu)點(diǎn)[7]。本研究應(yīng)用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化纖維素酶輔助提取紅旱蓮中總黃酮的方法，以期為紅旱蓮藥材的工業(yè)化開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅旱蓮（安國(guó)市冷背藥材有限公司，經(jīng)石家莊學(xué)院化工學(xué)院生藥教研室岳紅坤副教授鑒定為Hypericum ascyron L.）；蘆?。ㄖ袊?guó)藥品生物制品檢定所）；纖維素酶（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，酶活力≥150 000 U/g）；其他試劑均為分析純；水為石英高純水。

UV/VIS-916型紫外分光光度計(jì)（澳大利亞GBC科學(xué)器材有限公司）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；YJ501型超級(jí)恒溫器（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取蘆丁對(duì)照品11.6 mg，置于50 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并定容，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精確量取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，各置于25 mL量瓶中，加0.1 mol/L三氯化鋁溶液3 mL，pH 4.5醋酸-醋酸鈉緩沖溶液5 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以試劑空白作參比，在414 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為A=0.021 7+39.517 5 C，r=0.999 6。

1.2.2 紅旱蓮總黃酮提取率的測(cè)定 精確量取2 mL樣品液至25 mL量瓶中，按“1.2.1”的方法操作，在414 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算總黃酮濃度，根據(jù)公式計(jì)算紅旱蓮總黃酮的提取率。

提取率（mg/g） =

■

1.2.3 單因素試驗(yàn) 分別考察酶解過(guò)程中酶解溫度、pH、酶用量及酶解時(shí)間對(duì)紅旱蓮總黃酮提取率的影響。①酶解溫度。取 6 份干燥紅旱蓮粉末各1.0 g，加入pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液12 mL，酶用量為1.0%（以紅旱蓮質(zhì)量為基礎(chǔ)），酶解溫度分別為35、40、45、50、55、60 ℃，酶解時(shí)間 2 h。②pH。取 6 份干燥紅旱蓮粉末各 1.0 g，分別加入pH 為3.8、4.2、4.6、5.0、5.4和5.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液12 mL，酶用量1.0%，酶解溫度45 ℃，酶解時(shí)間 2 h。③酶用量。 取 6份干燥紅旱蓮粉末各 1.0 g，加入pH 5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液12 mL，酶用量分別為 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，45 ℃酶解2 h。④酶解時(shí)間。 取6 份干燥紅旱蓮粉末各 1.0 g，加入pH 5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液12 mL，酶用量為1.0%，酶解溫度 45 ℃，酶解時(shí)間分別為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h。各單因素試驗(yàn)酶解反應(yīng)完成后，將提取液煮沸 3 min，使酶滅活。加入28 mL無(wú)水乙醇，于60 ℃超聲波清洗器中提取1 h，過(guò)濾，轉(zhuǎn)移濾液至 50 mL容量瓶定容，測(cè)定 A414 nm，計(jì)算總黃酮提取率。

1.2.4 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定每個(gè)因素的3個(gè)水平（表1），進(jìn)行L9（43）正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶解溫度對(duì)紅旱蓮總黃酮提取率的影響 隨溫度的升高，紅旱蓮總黃酮提取率提高，45 ℃時(shí)總黃酮提取率最高，繼續(xù)升高溫度，總黃酮提取率迅速降低（圖1）。這是因?yàn)樯邷囟葘?duì)酶解反應(yīng)具有雙重影響：一方面會(huì)提升酶的活性，加快反應(yīng)速度；另一方面溫度過(guò)高會(huì)降低酶的活性，甚至失活，同時(shí)還可能引起已溶出黃酮的部分分解[8]。所以選擇45 ℃為纖維素酶的最適酶解溫度。

2.1.2 pH對(duì)紅旱蓮總黃酮提取率的影響 紅旱蓮總黃酮提取率隨pH的升高，明顯提高，但當(dāng)緩沖溶液pH高于5.4時(shí)，總黃酮提取率又開始下降（圖2）。這說(shuō)明纖維素酶處于pH 5.4的弱酸性環(huán)境時(shí)，能發(fā)揮其最高活性。繼續(xù)增大或減小pH，都會(huì)引起酶活性不同程度地降低，酶解反應(yīng)速度相應(yīng)減緩，所以選擇pH以5.4左右為宜。

2.1.3 酶用量對(duì)紅旱蓮總黃酮提取率的影響 紅旱蓮總黃酮的提取率隨酶用量的不同而不同（圖3），其先隨酶用量的增加而迅速上升， 1.0%時(shí)達(dá)到最大，為12.93 mg/g，此后又逐漸降低。酶用量對(duì)反應(yīng)速度的影響具有飽和現(xiàn)象，超出合適用量，酶的催化作用不但不會(huì)加強(qiáng)，還會(huì)受到抑制，從而影響總黃酮提取率[9]。本試驗(yàn)條件下，纖維素酶最佳添加量為1.0%。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)紅旱蓮總黃酮提取率的影響 由圖4可以看出，酶解2.0 h基本完成，即達(dá)到最佳提取紅旱蓮總黃酮的效果，繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，提取率反而下降。這是因?yàn)槊附猱a(chǎn)物濃度的增加，對(duì)纖維素的水解產(chǎn)生抑制作用[8]。本試驗(yàn)以酶解時(shí)間2.0 h為宜。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，酶解時(shí)間對(duì)紅旱蓮總黃酮提取率影響最大，各因素的作用強(qiáng)度從大到小依次為酶解時(shí)間、酶用量、酶解溫度、pH。酶法輔助提取紅旱蓮總黃酮的最佳工藝條件為A1B2C2D1，即酶解溫度35 ℃，pH 5.2，酶用量1.5%，酶解時(shí)間1.0 h。這與單因素試驗(yàn)得出的最佳工藝條件不同，說(shuō)明多因素作用時(shí)各因素間存在相互影響和交互作用。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

按照上述確定的最佳工藝條件，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，以不加酶為對(duì)照，3次重復(fù)，結(jié)果列于表3。最佳工藝條件下，紅旱蓮總黃酮的提取率為13.26 mg/g，高于正交試驗(yàn)中的各組合試驗(yàn)結(jié)果，與直接超聲提取法相比，纖維素酶解預(yù)處理可明顯提高紅旱蓮總黃酮的提取效果，提取量增加了10.2%。

2.4 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取同一供試品溶液，按照“1.2.2”的方法測(cè)定吸光度，平行操作6 次，計(jì)算得到吸光度RSD為0.07%（n=6）。

重復(fù)性試驗(yàn)：在相同條件下，將同一批樣品制成6份樣品溶液，分別測(cè)定總黃酮提取率，平均值為12.93 mg/g，RSD為0.87%（n=6）。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：按照樣品測(cè)定方法操作，分別在10、20、30、40、50、60 min 測(cè)定同一樣品溶液的吸光度，計(jì)算 RSD為0.38%（n=6），結(jié)果表明樣品提取液中的總黃酮在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

回收率試驗(yàn)：精確稱取已知總黃酮含量的紅旱蓮粉末，共6份，分別加入與樣品總黃酮含量80%、100%、120%相當(dāng)?shù)奶J丁對(duì)照品溶液，按“1.2.3”的方法操作，按照“1.2.2”的方法測(cè)定，計(jì)算總黃酮含量，回收率分別為101.2%、103.5%和107.3%，平均回收率為104.0%。

3 小結(jié)與討論

測(cè)定植物總黃酮含量的方法主要是Al（NO3）3-NaNO2-NaOH顯色法，但此法有一定局限性，當(dāng)植物中含有山柰酚、橙皮苷、綠原酸、咖啡酸等化合物時(shí)不宜采用該方法測(cè)定[10]。旱蓮、紅旱蓮藥材中含有山柰酚、綠原酸成分[11，12]，若采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH顯色法，測(cè)定誤差較大，故本試驗(yàn)采用AlCl3-醋酸鹽緩沖溶液比色法對(duì)紅旱蓮中總黃酮提取率進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率進(jìn)行了考察。

紅旱蓮藥材中纖維素含量較高，可能是影響總黃酮溶出的主要因素。加入纖維素酶，可特異性地降解纖維素，破壞細(xì)胞壁，從而使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)更大程度地溶出。本試驗(yàn)采用綠色木霉產(chǎn)纖維素酶用于紅旱蓮總黃酮的提取，并優(yōu)化出酶法輔助提取的最佳工藝條件：按酶用量1.5%加入紅旱蓮干粉中，在pH 5.2、溫度35 ℃下，酶解1.0 h后，再超聲提取，總黃酮提取率可達(dá)13.26 mg/g，比直接超聲提取提高了10.2%，為紅旱蓮黃酮類化合物的開發(fā)提供了一種新的有效方法。

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