摘要：試驗(yàn)探討了不同條件下保存和運(yùn)輸牛卵巢的效果。結(jié)果表明，37 ℃、2 h效果最佳；25 ℃、9 h比較實(shí)用；而4 ℃保存可以在20 h以上長途運(yùn)輸。

關(guān)鍵詞：牛；卵巢；儲(chǔ)運(yùn)

中圖分類號(hào)：S814.8；S823 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）21-5253-02

The Storage and Transport Conditions of Bovine Ovary

LIU Xi-mei，BI Yan-zhen，LI Li，XIAO Hong-wei，HUA Zai-dong，ZHOU Mu-qing，HUA Wen-jun， ZHANG Li-ping

（Institute of Animal husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agriculture Sciences/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo and Molecular Breeding，Wuhan 430064，China）

Abstract： In this study the storage and transport effect of bovine ovary under different conditions were discussed. The results showed that the best storage effect was under 37 ℃ and stored 2 hours. Under 25 ℃ and stored 9 hours was more practical. Stored under 4 ℃， the bovine ovary transported long-distance for more than 20 hours.

Key words： cattle； ovary； storage-transportation

牛卵巢是一種非常重要的稀缺資源，其儲(chǔ)存和運(yùn)輸條件直接影響到后期利用效率。為了減少外部環(huán)境變化對(duì)牛卵巢后期利用的影響，眾多研究者主張抽取新鮮卵巢中的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)[1，2]。然而，在現(xiàn)實(shí)操作中屠宰場與實(shí)驗(yàn)室相距甚遠(yuǎn)，很難保證在極短的時(shí)間內(nèi)將卵巢送到實(shí)驗(yàn)室，卵巢采集后如何儲(chǔ)存和運(yùn)輸成為體外胚胎研究的第一道關(guān)口。為此，本試驗(yàn)從不同角度探索了牛卵巢的儲(chǔ)運(yùn)條件，以期提高對(duì)這一資源的利用效率。

1 材料與方法

1.1 卵巢

從武漢市牛屠宰點(diǎn)采集，置于儲(chǔ)存液（加雙抗的生理鹽水）中保存，以等溫（采集、保存、運(yùn)輸?shù)冗^程保持同一溫度）保溫箱進(jìn)行儲(chǔ)存和運(yùn)輸。

1.2 試劑

卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液：TCM-199+10%FBS+10 IU/mL PMSG+100 IU/mL雙抗，受精卵培養(yǎng)液CRlaa。受精試劑：BO液+10 mg/mL肝素鈉等[3]。

1.3 卵母細(xì)胞采集及培養(yǎng)方法

用預(yù)熱的生理鹽水清洗卵巢3次，然后用帶20#針頭的10 mL一次性注射器抽取直徑為3～8 mm的卵泡，抽取液注入39 ℃、50 mL尖底離心管中。用杜氏磷酸緩沖液（DPBS）洗滌2次，在體視顯微鏡下檢卵，將撿取的卵母細(xì)胞用DPBS洗滌3次，成熟培養(yǎng)液洗滌3次，移入含有成熟培養(yǎng)液滴的直徑35 mm培養(yǎng)皿中。每個(gè)液滴50 μL并覆蓋石蠟油，每滴放COCs（卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體）10～15枚。液滴預(yù)先平衡2 h以上。成熟培養(yǎng)條件：100%濕度、39 ℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)22～24 h[4]。

1.4 體外受精

將體外成熟培養(yǎng)22～24 h的COCs用0.25%的胰酶進(jìn)行消化處理后，撿取有第一極體的卵母細(xì)胞進(jìn)行受精。精子獲能處理：BO液+10 mmol/L咖啡因+10 mg/mL肝素鈉。成熟卵子放入濃度為3×106個(gè)/mL并且已經(jīng)獲能的體外受精懸浮液滴中，在與成熟培養(yǎng)條件相同的條件下培養(yǎng)5 h，然后用受精卵培養(yǎng)液CRlaa（10～15枚/50 μL）進(jìn)行體外培養(yǎng)[5]。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

①卵巢采集后，分別在20、25和30 ℃儲(chǔ)存液（加雙抗的生理鹽水）中儲(chǔ)運(yùn)9 h，對(duì)比3種溫度對(duì)牛卵母細(xì)胞體外受精胚胎后期發(fā)育的影響；②卵巢采集后，對(duì)比37 ℃、2 h儲(chǔ)運(yùn)和4 ℃條件下儲(chǔ)運(yùn)對(duì)牛卵母細(xì)胞體外受精胚胎后期發(fā)育的影響。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

卵巢采集后，在不同溫度條件下儲(chǔ)運(yùn)9 h，然后抽取卵母細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)果見表1。由表1可見，3種溫度條件下卵母細(xì)胞的成熟率差別比較明顯，以25 ℃條件下的效果最好；但就卵裂率而言，20 ℃與25 ℃條件下沒有明顯差別，30 ℃時(shí)則明顯降低。這一結(jié)果與彭輝等[6]的研究結(jié)果有些出入，分析其原因可能與卵巢采集的條件及季節(jié)有關(guān)。

卵巢采集后，37 ℃、2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，抽取其卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)，其成熟率超過70%以上。這一結(jié)果與多數(shù)研究結(jié)果一致，屬于第一優(yōu)選方案[7]。

卵巢采集后，4 ℃條件下儲(chǔ)運(yùn)，無論時(shí)間長短，對(duì)后期試驗(yàn)均極為不利，這與王鵬征[8]的研究結(jié)果相似。但作為長時(shí)間（20 h以上）儲(chǔ)運(yùn)，則屬于一種無奈的選擇方法。

3 小結(jié)與討論

卵巢儲(chǔ)運(yùn)在很大程度上直接影響抽取卵母細(xì)胞的數(shù)量、質(zhì)量、成熟培養(yǎng)效果、體外受精能力及體細(xì)胞克隆效率等，所以理論上以即殺、即取、即用為好，這樣可以減少污染，縮短卵巢離體到培養(yǎng)的時(shí)間，使卵母細(xì)胞的活力更旺盛[2]。然而，在現(xiàn)實(shí)操作中屠宰場距離實(shí)驗(yàn)室總會(huì)有一定的距離，或者宰殺的時(shí)間與工作時(shí)間有差異，難以保證其實(shí)效性，這就需要對(duì)其保存和運(yùn)輸一段時(shí)間，一般需要2 h，長的可達(dá)9～10 h，有的則需要24 h[8]，這一過程中，以下3個(gè)條件最為重要，即①溫度。太低或太高的溫度對(duì)卵巢儲(chǔ)運(yùn)都不利，低溫的過度刺激不利于后期卵母細(xì)胞的發(fā)育，成熟率明顯偏低，筆者的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果及王鵬征[8]的研究結(jié)果都證明了這一點(diǎn)；而高溫時(shí)細(xì)胞的代謝快，短時(shí)間（2 h）內(nèi)影響較小，長時(shí)間則會(huì)使取出的卵母細(xì)胞活力下降，成熟率明顯降低[6]；只有在一個(gè)合適的溫度下，才能長時(shí)間保持細(xì)胞的活力。First等[9]報(bào)道，當(dāng)卵巢的貯存溫度低于30 ℃時(shí)，會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞的成熟和隨后的胚胎發(fā)育產(chǎn)生不利的影響。從本試驗(yàn)結(jié)果看，在本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件下9 h儲(chǔ)運(yùn)以25 ℃為最佳貯存溫度。2 h內(nèi)儲(chǔ)運(yùn)以37～39 ℃較為適宜[4]，20 h以上的長時(shí)間儲(chǔ)運(yùn)則在4 ℃條件下可以得到較滿意的結(jié)果[8]。②保存液。蒸餾水是低滲液，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞溶脹，不宜使用；PBS（緩沖液）及其他培養(yǎng)液成本高，不經(jīng)濟(jì)；用生理鹽水作保存液成本較低，對(duì)細(xì)胞無傷害，各實(shí)驗(yàn)室及生產(chǎn)單位基本采用生理鹽水作為儲(chǔ)運(yùn)液[10]。③添加抗生素。20 ℃以上長時(shí)間儲(chǔ)運(yùn)，如果不添加抗生素則幾乎全部被污染。所以操作者多在其中添加青霉素和鏈霉素各100 IU/mL[10]，既廉價(jià)又實(shí)用。

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