摘要：應(yīng)用石蠟切片及HE染色技術(shù)觀察轉(zhuǎn)基因克隆水牛牛犢的心臟、肝、腎、胰腺、睪丸等主要臟器組織結(jié)構(gòu)，并使用激光共聚焦顯微鏡對其心臟、肝、腎、睪丸冰凍組織切片進(jìn)行熒光觀察。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因克隆水牛心臟結(jié)構(gòu)異常，心肌纖維間隙過大，閏盤結(jié)構(gòu)不明顯，出現(xiàn)炎癥、出血等病理現(xiàn)象；肝、腎、胰腺、睪丸結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)、分布均正常。激光共聚焦顯微鏡下各冰凍組織切片中均可見較均勻綠色熒光，初步證實(shí)綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）基因成功整合到了水牛體內(nèi)。

關(guān)鍵詞：水牛；轉(zhuǎn)基因克隆；臟器；組織結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S814.8 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號：0439-8114（2013）21-5251-02

Observation of Main Visceral Organ Structure in one Transgenic Cloned Buffalo

LU Jun-qiu，HU Wei-kun，ZHOU Yue，WANG Xiao-li

（College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning 530005， China）

Abstract： The main visceral organs such as heart，

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物克隆技術(shù)是20世紀(jì)中后期興起的一項(xiàng)技術(shù)。近年來，隨著轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的發(fā)展和深入，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、免疫學(xué)、生物制藥及畜牧育種等領(lǐng)域[1，2]。

2010年初，廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院的科研人員將一只3月齡的水牛胎兒的成纖維細(xì)胞經(jīng)體外傳代培養(yǎng)后，把含標(biāo)記基因[綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）]和篩選基因的轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入，構(gòu)建得到轉(zhuǎn)基因克隆重構(gòu)胚，并于2010年2月5日植入一頭2歲半的母牛子宮內(nèi)。同年12月19日順利產(chǎn)下一對雄性雙胞胎。其中一頭體重為20.5 kg，正常存活；另一頭體重為14 kg，夭折，無法憑外部觀察判斷死因。對夭折牛犢用紫外燈照射，可見頭部和四肢明顯表達(dá)綠色熒光蛋白基因[3]。

本試驗(yàn)試圖通過組織冰凍切片和熒光顯微觀察技術(shù)查證外源基因是否成功轉(zhuǎn)入水牛的內(nèi)部組織器官；并通過石蠟切片和HE染色技術(shù)對轉(zhuǎn)基因克隆水牛主要臟器組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察分析，為探查犢牛死亡原因提供理論依據(jù)，也為今后轉(zhuǎn)基因克隆水牛的研究提供必要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

心臟、肝、腎、胰腺、睪丸組織取材于廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院的轉(zhuǎn)基因克隆水牛。所取以上部分器官組織用75%的乙醇固定，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后切片（厚度約7 μm），HE染色[4，5]，顯微鏡下觀察、攝片。其余心臟、肝、腎、睪丸組織于包埋劑中在冷凍臺(tái)上迅速冷凍固定，切片（厚度5～10 μm），激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察、攝片[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因克隆水牛組織HE染色切片觀察

在4×10倍光鏡下，對轉(zhuǎn)基因克隆水牛心肌膜組織切片觀察，可見心肌膜內(nèi)的心肌纖維間隔多且寬；心肌纖維間隔中分布大量結(jié)締組織（圖1）。10×10倍光鏡下，可見心臟橫紋肌不明顯，閏盤結(jié)構(gòu)不明顯，心肌纖維間可見破裂的血管，在其周圍分布大量細(xì)胞群（圖2）。40×10倍光鏡下，可見心肌間有大量血細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及少量淋巴細(xì)胞（圖3）。轉(zhuǎn)基因克隆水牛肝、腎、胰腺、睪丸的HE染色組織切片分別在4×10倍、10×10倍、40×10倍光鏡下觀察，組織結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞形態(tài)分布正常，沒有病理異常現(xiàn)象。

2.2 轉(zhuǎn)基因克隆水牛組織冰凍切片觀察

在激光共聚焦顯微鏡下，用波長為488 nm的光波透射過冰凍切片，可觀察到心臟、肝、腎、睪丸組織冰凍切片均呈現(xiàn)一片較為均勻的綠色熒光（圖4）。

3 小結(jié)與討論

在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物工程中，常用綠色熒光蛋白基因與外源DNA相融合，再將外源基因?qū)雱?dòng)物體，從而便于對基因轉(zhuǎn)入結(jié)果進(jìn)行檢測。若轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)各組織器官產(chǎn)生綠色熒光，且熒光顏色均勻，說明外源基因整合成功；若轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)只有少部分組織器官或某個(gè)部位產(chǎn)生綠色熒光，說明外源基因整合不理想或不成功[7]。本試驗(yàn)中在激光共聚焦顯微鏡下，轉(zhuǎn)基因克隆水牛的心臟、肝、腎、睪丸組織冰凍切片均呈現(xiàn)出一片綠色熒光，因此可初步判斷GFP基因已成功整合進(jìn)該頭水牛的內(nèi)部組織中。

正常繁殖方式出生牛的心肌膜內(nèi)的心肌纖維成螺旋狀排列，多集合成束，心肌纖維之間較緊密并有閏盤特殊連接[8]。轉(zhuǎn)基因克隆水牛的心肌纖維出現(xiàn)肌纖維間隙過大、閏盤結(jié)構(gòu)不明顯等異變，表明該水牛心臟結(jié)構(gòu)異常；心肌膜還出現(xiàn)出血和發(fā)炎癥狀，這些癥狀都影響了心臟的收縮力度，導(dǎo)致心功能降低。同時(shí)，對該轉(zhuǎn)基因克隆水牛的肝、腎、胰腺、睪丸組織HE染色切片觀察表明，其結(jié)構(gòu)形態(tài)均和正常繁殖方式出生的水牛類似，功能正常。因此，可初步判斷該轉(zhuǎn)基因克隆牛犢夭折可能是由于心臟功能下降引起的。

參考文獻(xiàn)：

[1] 崔文濤.轉(zhuǎn)基因牛研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2007，34（7）：47-50.

[2] 張 賀，王承利.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008（7）：59-62.

[3] 陸月玲.世界首例轉(zhuǎn)基因克隆水牛在邕問世[N].南國今報(bào)，2010-12-20.

[4] 芮菊生.組織切片技術(shù)[M]. 北京：人民教育出版社，1980.

[5] 王 平.組織學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：北京大學(xué)出版社，1981.

[6] 孟運(yùn)蓮，付承英.組織學(xué)與胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（雙語）[M].武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2006.

[7] 王燕容，何仲義.形態(tài)學(xué)實(shí)用技術(shù)[M]. 上海：第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2010.

[8] 沈霞芬.家畜組織學(xué)與胚胎學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.