摘要：試驗針對枳[Poncirus trifoliata （L.） Raf.]CBF啟動子序列順式作用元件預(yù)測結(jié)果，設(shè)計特異引物并PCR擴(kuò)增分離了元件順序缺失片段，與基本表達(dá)載體pCAMBIA1391Z連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒DNA后，通過雙酶切、PCR及測序篩選出R0-7、R3-10、R4-8、R5-10、R6-10、R7-10和R8-10陽性轉(zhuǎn)化子，成功構(gòu)建了枳CBF啟動子缺失表達(dá)載體，為枳CBF啟動子順式作用元件功能驗證奠定了基礎(chǔ)，為啟動子核心元件篩選和轉(zhuǎn)基因高效抗寒柑橘育種提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：枳[Poncirus trifoliata （L.） Raf.]；抗寒性；CBF啟動子；表達(dá)載體

中圖分類號：S666；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）21-5228-05

Construction of Expression Vector of Trifoliate Orange Driven by CBF Promoter with Partial Deletion

HE Li-gang，JIANG Ying-chun，XU Miao，TONG Zhu，WU Li-ming，WANG Zhi-jing，SUN Zhong-hai

（Institute of Fruit and Tea， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430209， China）

Abstract：The transcription factor CBF known as master switch plays an important role during cold acclimation and responses to low temperature. In this study， the genomic DNA fragments with partial deletion in CBF promoter of trifoliate orange[Poncirus trifoliata（L.） Raf.] were isolated by PCR amplification， and ligated with expression vector pCAMBIA1391Z after column purification followed by double digestion， then transformed into E. coli DH5α. Finally， R0-7、R3-10、R4-8、R5-10、R6-10、R7-10 and R8-10 were selected as positive transformants by double digestion and gene-specific PCR amplification with the plasmid DNAs extracted by alkaline lysis， then verified by nucleotide sequencing. The results are helpful for the further functional characterization of cis-action elements in trifoliate orange CBF promoter and high-efficiency transgenic citrus breeding for cold-resistant varieties.

Key words：citrus[Poncirus trifoliata （L.） Raf.]；cold resistance；CBF promoter；expression vector

植物抗寒性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CBF/DREB1（C-Repeat Binding Factor/Dehydration-Responsive Element Binding protein）屬于AP2/ERF（APETALA2/Ethylene-Responsive Element Binding Factor）類型轉(zhuǎn)錄因子，模式植物擬南芥中由CBF1/DREB1B、CBF2/DREB1A、CBF3/DREB1C、CBF4/DREB1D組成蛋白質(zhì)家族，能夠特異結(jié)合下游靶基因啟動子區(qū)CRT/DRE 元件，激活下游一系列冷調(diào)節(jié)基因COR（Cold-regulated genes）的表達(dá)，翻譯合成RNA 結(jié)合蛋白、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、去飽和酶、糖代謝相關(guān)蛋白、LEA蛋白、KIN蛋白、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成相關(guān)蛋白以及蛋白酶抑制劑等細(xì)胞保護(hù)物質(zhì)，從而提高植物的抗寒性，被認(rèn)為是植物冷馴化過程中基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的“主開關(guān)”，因此CBF轉(zhuǎn)錄因子在植物低溫響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用[1-3]。

轉(zhuǎn)基因試驗結(jié)果表明，抗寒相關(guān)基因的超量表達(dá)可以有效提高植物的低溫耐受性[4]。然而，基因高效表達(dá)依賴于適宜的啟動子，因此啟動子的選擇尤為關(guān)鍵。啟動子依據(jù)其特性可以分為組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子，其中誘導(dǎo)型啟動子具有選擇性激活特性，可以調(diào)控目標(biāo)基因的高效表達(dá)。目前，柑橘抗寒性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CBF基因及其啟動子已經(jīng)被成功克隆，經(jīng)過生物信息學(xué)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，枳[Poncirus trifoliata （L.） Raf.]CBF啟動子序列中含有多種脅迫相關(guān)順式作用元件，如ABRE、MYB、MYC、LTRE以及Circadian生物鐘響應(yīng)元件等[5]。為了進(jìn)一步獲得枳CBF啟動子區(qū)核心元件信息，本研究構(gòu)建了枳CBF啟動子元件順序缺失表達(dá)載體，從而為冷誘導(dǎo)活性啟動子元件篩選奠定基礎(chǔ)，并為轉(zhuǎn)基因高效抗寒柑橘育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

枳來自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所柑橘試驗基地，采集枳健康、幼嫩的葉片于自封樣品袋中，標(biāo)記后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

載體構(gòu)建選用的基本表達(dá)載體為pCAMBIA1391Z，具卡那霉素抗性（KanR），攜帶GUS（β-Glucuronidase）報告基因；遺傳轉(zhuǎn)化受體菌為大腸桿菌DH5α菌株。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 枳基因組DNA采用改良CTAB法提取[6]。

1.2.2 啟動子元件順序缺失片段的克隆 針對枳CBF啟動子序列順式作用元件預(yù)測信息，采取元件順序缺失方式設(shè)計擴(kuò)增特異引物。為簡化操作流程，在綜合分析基本表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)信息、限制性內(nèi)切酶雙酶切條件及保護(hù)堿基對酶切活性影響之后，直接在啟動子缺失片段擴(kuò)增引物5′端分別引入PstⅠ（CTGCA|G）和EcoRⅠ（G|AATTC）酶切位點(diǎn)，啟動子各缺失片段擴(kuò)增特異引物序列信息見表1。基因片段克隆PCR擴(kuò)增采用大連寶生物工程公司的高保真DNA聚合酶，PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 2.0 μL，10×ExTaq PCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture （2.5 mmol/L each）4.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，ExTaq DNA 聚合酶0.5 μL，dd H2O補(bǔ)足至50.0 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用上海生工UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒純化和回收。

1.2.3 CFB啟動子缺失片段與基本表達(dá)載體的雙酶切及其連接 由于PCR擴(kuò)增片段中含有PstⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，故直接采用NEB公司高保真限制性內(nèi)切酶PstⅠ-HF和EcoRⅠ-HF進(jìn)行大體系雙酶切。雙酶切反應(yīng)體系為：純化后PCR產(chǎn)物 20.0 μL，10× Buffer 10.0 μL，PstⅠ-HF和EcoRⅠ-HF各3.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至100.0 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中酶切12～16 h?；颈磉_(dá)載體雙酶切反應(yīng)體系和條件同上。反應(yīng)完成后，采用上海生工UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒分別純化，最后采用40 μL Elution Buffer溶解洗脫，洗脫產(chǎn)物直接用于連接。連接體系為：啟動子缺失片段 6.0 μL，表達(dá)載體片段 2.0 μL（混勻后45 ℃水浴5 min，完成后置于冰上冷卻），10× Buffer（NEB）1.0 μL，T4 DNA Ligase（NEB，400 U/μL）1.0 μL，共10.0 μL，16 ℃連接12～16 h。

1.2.4 大腸桿菌感受態(tài)的制備及遺傳轉(zhuǎn)化 大腸桿菌感受態(tài)的制備采用CaCl2法[7]。大腸桿菌遺傳轉(zhuǎn)化采用凍融熱激法。在預(yù)冷的1.5 mL離心管中依次加入10 μL“1.2.3”中的連接產(chǎn)物和50 μL冰上凍融的E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，輕輕吸打混勻，冰浴30 min。冰浴完成后將離心管置于42 ℃水浴熱激90 s，然后快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰上，冰鎮(zhèn)2～3 min。最后加入400 μL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)復(fù)蘇45～60 min。吸取200 μL復(fù)蘇后的菌液均勻涂布于LB抗性平板（Kan終濃度100 μg/mL）上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置暗培養(yǎng)12～16 h。

1.2.5 陽性轉(zhuǎn)化子的篩選及測序驗證 挑取大腸桿菌平板上形狀規(guī)則、較大的單菌落于5 mL含有100 μg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)12～16 h，振蕩速率200 r/min。采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA[7]。為了篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，采用雙酶切進(jìn)行初選，PCR擴(kuò)增進(jìn)行復(fù)選，最后采用基因測序進(jìn)行決選。雙酶切反應(yīng)體系及條件為：質(zhì)粒DNA 4.0 μL，10×Buffer（NEB） 2.0 μL，Pst Ⅰ-HF和EcoRⅠ-HF各1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中酶切12～16 h。PCR擴(kuò)增體系及條件為：質(zhì)粒DNA模板0.5 μL，2×PCR Mixture（BioMed） 10.0 μL，正義引物和反義引物各0.4 μL，無菌甘油1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL，擴(kuò)增參數(shù)同基因克隆。增殖培養(yǎng)過夜菌液送華大基因研究院進(jìn)行序列雙向測序，測序結(jié)果采用Bioedit（Ver. 7.0.5.3）進(jìn)行序列比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枳CBF啟動子元件順序缺失基因片段的克隆及回收純化

通過PCR擴(kuò)增共獲得枳CBF啟動子7條啟動子缺失片段，分別標(biāo)記為R0、R3～R8（圖1）。其中R0沒有缺失順式作用元件；R3相對于R0缺失了4個MYB、2個MYC以及1個ABRE元件，驗證MYB、MYC和ABRE對啟動子活性的影響[8]；R4缺失1個LTRE元件，LTRE元件具有冷誘導(dǎo)活性，可能是枳CBF啟動子低溫響應(yīng)活性的關(guān)鍵元件；R5與R4比較減少了Circadian元件，前人研究表明擬南芥CBF基因的表達(dá)受生物鐘的調(diào)節(jié)，因此Circadian元件在CBF表達(dá)調(diào)控中可能發(fā)揮重要作用[9]；R6和R7用于驗證啟動子中正向重復(fù)序列的功能；R8驗證CBF上游轉(zhuǎn)錄因子ICE蛋白結(jié)合序列IBox對于CBF基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控作用[10]。為了進(jìn)一步構(gòu)建啟動子元件缺失表達(dá)載體，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行了回收純化，回收片段于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 連接后轉(zhuǎn)化子陽性克隆雙酶切初步篩選

枳CBF啟動子缺失片段與基本表達(dá)載體在分別大體系雙酶切后，經(jīng)過過柱純化分別獲得帶有黏性末端的目的片段和表達(dá)載體片段，進(jìn)一步連接并遺傳轉(zhuǎn)化大腸桿菌。每一啟動子缺失片段挑取10個轉(zhuǎn)化子以增殖培養(yǎng)，分別提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行后期陽性篩選。R0中2、5、7含有目的片段大小片段，可能為陽性質(zhì)粒，其余以空載為主（圖2）；R3中6、10酶切小片段與目的片段大小一致，3產(chǎn)物小片段明顯大于目的片段（圖3）；R4篩選過程中酶切片段分離較復(fù)雜，6、8片段與目的片段大小基本一致，作為候選質(zhì)粒（圖4）；R5雙酶切后1、2、4、5、6、9、10大小一致，3片段較小（圖5）；R6、R7酶切產(chǎn)物全部表現(xiàn)為陽性（圖6、圖7）；R8篩選1、2、4、7、9、10號質(zhì)?？赡転殛栃裕?號酶切片段較其他片段稍大（圖8）。

2.3 雙酶切候選陽性質(zhì)粒的PCR復(fù)選及測序決選

為進(jìn)一步確定質(zhì)粒是否為陽性，在雙酶切初步篩選的基礎(chǔ)上，必須以候選陽性質(zhì)粒DNA為模板通過基因擴(kuò)增特異引物進(jìn)行PCR驗證，同時擴(kuò)增GUS片段，以雙重驗證陽性質(zhì)粒。PCR驗證過程中，R0-2、R0-5、R0-7，R3-6、R3-10，R4-6、R4-8，R5-1、R5-2、R5-4、R5-5、R5-6、R5-9、R5-10，R6-1至R6-10，R7-1至R7-10和R8-1、R8-2、R8-4、R8-7、R8-9、R8-10質(zhì)粒PCR結(jié)果表現(xiàn)陽性，基本可以確定為陽性質(zhì)粒（圖9至圖15）。為了完全確定陽性轉(zhuǎn)化子，選取轉(zhuǎn)化子R0-7、R3-10、R4-8、R5-10、R6-10、R7-10、R8-10進(jìn)行了測序驗證。測序結(jié)果經(jīng)過比對分析表明，R0-7、R3-10、R4-8、R5-10、R6-10、R7-10、R8-10均為陽性轉(zhuǎn)化子，至此枳CBF啟動子缺失表達(dá)載體構(gòu)建成功。

3 小結(jié)與討論

3.1 常規(guī)策略無法獲得大腸桿菌轉(zhuǎn)化子可能與EB替代類染料或水質(zhì)有關(guān)

在載體構(gòu)建過程中，最初采用常規(guī)載體構(gòu)建策略，然而通過多次試驗始終無法得到轉(zhuǎn)化子，連接沒有成功，初步判斷可能原因是DNA回收純化濃度過低。為了解決這一問題，采取批量回收啟動子缺失片段和載體片段后合并樣品重新沉淀DNA以獲得高濃度樣品，重新連接、遺傳轉(zhuǎn)化大腸桿菌仍然無法獲得轉(zhuǎn)化子，而對照樣品布滿菌落，說明無法連接不是由于低濃度原因?qū)е?，可能與黏性末端丟失有關(guān)。在更換高效連接酶和高保真限制性內(nèi)切酶后仍然沒有獲得轉(zhuǎn)化菌落。排除以上影響因素，結(jié)合經(jīng)驗綜合分析以往試驗方案和現(xiàn)有試驗條件，黏性末端丟失可能與凝膠電泳EB替代染料GelGreen和水質(zhì)有關(guān)，還需進(jìn)一步的試驗驗證。

3.2 大腸桿菌陽性率與目的基因序列長度和載體片段DNA純度有密切關(guān)系

在改進(jìn)試驗方案后，成功獲得了大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，然而轉(zhuǎn)化效率較低，同時陽性效率明顯偏低。對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行統(tǒng)計，平均陽性率為55.7%，最低僅為20.0%，小片段轉(zhuǎn)化效率明顯高于大片段，說明連接效率與序列長短有密切關(guān)系。其次，陽性率可能與連接片段中基本表達(dá)載體質(zhì)粒DNA提取質(zhì)量有關(guān)，啟動子缺失片段R1最終測序表明插入序列為大腸桿菌基因組DNA，可能是在基本表達(dá)載體質(zhì)粒DNA提取過程中，部分大腸桿菌基因組DNA與質(zhì)粒DNA同步沉淀溶解造成DNA污染所致，因此，采用新鮮配制的試劑藥品，規(guī)范試驗操作流程，從而提高質(zhì)粒DNA提取純度，可以有效增加載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化子陽性率，大幅提高試驗效率。

參考文獻(xiàn)：

[1] THOMASHOW M F， GILMOUR S J， STOCKINGER E J， et al. Role of the Arabidopsis CBF transcriptional activators in cold acclimation[J]. Physiol Plant，2001，112（2）：171-175.

[2] FOWLER S， THOMASHOW M F. Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway[J]. The Plant Cell，2002，14（8）：1675-1690.

[3] MIZOI J，SHINOZAKI K， YAMAGUCHI-SHINOZAKI K. AP2/ERF family transcription factors in plant abiotic stress responses[J]. Biochimica et Biophysica Acta，2012，1819（2）：86-96.

[4] WANG Q Y， GUAN Y C， WU Y R， et al. Overexpression of a rice OsDREB1F gene increases salt， drought， and low temperature tolerance in both Arabidopsis and rice[J]. Plant Mol Biol，2008，67（6）：589-602.

[5] HE L G， WANG H L， LIU D C， et al. Isolation and expression of a cold-responsive gene PtCBF in Poncirus trifoliata and isolation of citrus CBF promoters[J]. Biologia Plantarum，2012， 56（3）：484-492.

[6] CHENG Y J， GUO W W， YI H L， et al. An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species[J]. Plant Mol Biol Reporter，2003，21（2）：177-178.

[7] 薩姆布魯克 J，拉塞爾 D W.分子克隆實驗指南[M].第三版.黃培堂，等，譯.北京：科學(xué)出版社，2002.

[8] AGARWAL M， HAO Y J， KAPOOR A， et al. A R2R3 type MYB transcription factor is involved in the cold regulation of CBF genes and in acquired freezing tolerance[J]. J Biol Chem， 2006，281（49）：37636-37645.

[9] FOWLER S G， COOK D， THOMASHOW M F. Low temperature induction of Arabidopsis CBF1，2， and 3 is gated by the circadian clock[J]. Plant Physiol，2005，137（3）：961-968.

[10] CHINNUSAMY V， OHTA M， KANRAR S， et al. ICE1： a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis[J]. Gene Dev，2003，17：1043-1054.