摘要：茄子黃萎病是嚴(yán)重影響茄子產(chǎn)量的土傳病害。為了有效控制該病害，從開花期茄子根莖中分離得到對(duì)黃萎病菌具有強(qiáng)烈抑制作用的內(nèi)生生防菌株QZ-8，其抑菌直徑達(dá)24 mm，經(jīng)16 S rDNA序列分析確定其為枯草芽孢桿菌。室內(nèi)定殖試驗(yàn)表明，QZ-8菌株能順利定殖于茄子根際和維管束中，最高定殖量可達(dá)1×105 CFU/g茄組織。另外QZ-8菌株可促進(jìn)茄種子的萌發(fā)、茄子幼苗及根系生長(zhǎng)。室內(nèi)盆栽試驗(yàn)表明，QZ-8對(duì)茄子黃萎病均具有很高的防效，可達(dá)78.98%，持效期較長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：茄子黃萎??；內(nèi)生菌；定殖；拮抗

中圖分類號(hào)：S432.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）21-5199-04

Roles of the Endogenous Bacillus Subtilis QZ-8 on the Disease Resistance and Promoting Growth of Eggplant

LU Hong-xue，YANG Ting-xian，YANG Pei，SUN Zheng-xiang， ZHOU Yi

（College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China）

Abstract：Eggplant Verticicillium wilt is a soil-borne disease which can result in great loss of the yield. To control this disease， endophytic antagonistic bacteria were collected in the flowering stage of eggplant. An antagonistic strain with the inhibition diameter 24 mm was isolated from the stem of eggplant. The 16 S rDNA sequence of the strain QZ-8 shares 99.0% sequence homology with that of Bacillus subtilis. Therefore， the strain is named B. subtilis QZ-8. The indoor colonization test showed that the strain QZ-8 could enter the eggplant and the number could reach 1×105 cfu/g. The strain QZ-8 can promote the germination of the eggplant seed and the growth of root and stem. The pot experiments showed that controlling effects of strain QZ-8 on eggplant wilt could be up to 78.98%.

Key words： eggplant wilt； Verticillium dahlia； Bacillus subtilis； colonization； control effect

茄子黃萎病是嚴(yán)重威脅其產(chǎn)量的一種土傳維管束病害，由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb）引起，俗稱半邊瘋、黑心病。該病原菌可以微菌核的形式在植物衰老組織中存活數(shù)年并保持侵染能力[1]，在土壤中能存活14年或更長(zhǎng)時(shí)間[2]，因此該病極難防治。

化學(xué)農(nóng)藥對(duì)茄子黃萎病的防治效果不理想。一方面，由于病菌主要從根部侵入，土壤的吸附和降解能力很強(qiáng)，農(nóng)藥進(jìn)入土壤很難殺死土壤中的病菌；另一方面，由于農(nóng)藥內(nèi)吸傳導(dǎo)性差，不能從植物地上部分進(jìn)入并有效地控制進(jìn)入作物維管束內(nèi)的病原菌。選育和種植抗病品種是防治這類病害的最有效途徑，但目前我國(guó)栽培品種中缺乏抗黃萎病的種質(zhì)資源[3]，水旱輪作能有效控制該病害的發(fā)生，但由于我國(guó)耕地面積的限制，這一措施很難實(shí)施。因此，對(duì)于這類病害目前還沒有很有效的防治措施。

拮抗菌成為近年來的研究熱點(diǎn)，內(nèi)生菌更是其中的一個(gè)研究方向。內(nèi)生細(xì)菌能定殖于植物體內(nèi)，部分還具有促生、抗病和固氮等功能，是重要的生物防治資源。由于內(nèi)生菌具有高效定殖能力，將在土傳病害、維管束病害的防治方面具有較好的應(yīng)用前景。本研究從茄子根莖部篩選到對(duì)黃萎病菌具有強(qiáng)拮抗作用的QZ-8菌株，對(duì)其定殖和防病功能進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種和品種

茄子黃萎病原菌（Verticillium dahliae）由長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供，茄子品種為三月茄。

1.2 主要培養(yǎng)基

PSA培養(yǎng)基：用于病原菌的培養(yǎng)。篩選培養(yǎng)基：分別稱取新鮮茄子根100 g、蔗糖5 g、蛋白胨5 g、酵母浸出粉2 g和瓊脂15 g。將100 g茄子根用適量去離子水煮沸10 min，過濾，取過濾液，在濾液中添加蛋白胨、蔗糖和酵母粉，煮沸，最后加入瓊脂，定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 6.5～7.0，分裝滅菌后用于篩選和培養(yǎng)茄子內(nèi)生菌。

1.3 內(nèi)生菌芽孢桿菌的初級(jí)分離

在茄子開花期，選取茄子黃萎病發(fā)生嚴(yán)重的田塊，挑選長(zhǎng)勢(shì)好的健康茄子植株，取其根莖部，去皮、自來水洗凈、分別用75%酒精消毒5 min，0.1%升汞消毒2 mim，去離子水漂洗3次后剪碎并加入去離子水，在25 ℃下浸泡24 h（使維管束中的內(nèi)生菌充分游離出來）；于恒溫水浴鍋中加熱處理到至80 ℃，計(jì)時(shí)20 min（除去非芽孢桿菌），取液體30 μL涂平板，25 ℃恒溫培養(yǎng)，待其長(zhǎng)出菌落，挑選芽孢桿菌及類似菌落，進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)。

1.4 內(nèi)生菌的抗菌活性篩選

初篩：取病菌移接到裝有30 mL PSA液體培養(yǎng)基的三角瓶（100 mL）中， 25 ℃，150 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，吸取1mL病原菌溶液，注入45 ℃左右的PSA培養(yǎng)基（200 mL）中，混勻后倒平板，即得到含病原菌培養(yǎng)基。將分離所得菌株編號(hào)，分別在含菌培養(yǎng)基稀釋劃線后，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，選擇菌落周圍抑菌圈明顯的菌株，保存?zhèn)溆?。?fù)篩：制備含病菌平板（方法同初篩），在平板中用打孔器打直徑5 mm的4個(gè)孔（3個(gè)孔為處理組，1個(gè)孔為對(duì)照），用少許融化培養(yǎng)基封住孔底。將初篩內(nèi)生菌的發(fā)酵液于4 ℃下12 000 r/min離心20 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，吸取100 μL注入待測(cè)平板孔里，以去離子水作為對(duì)照，以抑菌帶寬度大小判定生防菌株的抑菌活性強(qiáng)弱，篩選出抑菌能力強(qiáng)的菌株。

1.5 QZ-8菌株對(duì)馬鈴薯的致病性測(cè)定

對(duì)復(fù)篩后表現(xiàn)較強(qiáng)抑菌活性的QZ-8菌株進(jìn)行致病性測(cè)定：將馬鈴薯洗凈，表面用75%的酒精消毒2 min，無菌水沖洗3次，切成薄片，放于含濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，接30 μL內(nèi)生菌發(fā)酵液于馬鈴薯片，對(duì)照加清水；25 ℃恒溫培養(yǎng)，48 h后檢測(cè)致病性。

1.6 QZ-8菌株對(duì)茄子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)的的影響

1）QZ-8菌株發(fā)酵液浸泡茄子種子1 d（對(duì)照用自來水），在培養(yǎng)皿內(nèi)放濕潤(rùn)濾紙，將浸泡后的種子轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿10粒種子，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察種子萌發(fā)情況及生長(zhǎng)情況。

2）取茄子地土樣，121 ℃高壓蒸汽滅菌，待冷卻后將內(nèi)生菌發(fā)酵液（4×108 cfu/mL）與土樣混合（按50 mL/kg比例混合），分裝于花盆中，設(shè)3次重復(fù)；將催芽后種子播種于花盆內(nèi)，以不加內(nèi)生菌的為CK1，加內(nèi)生菌QZ-5菌株的為CK2，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7 d后記錄出芽率，30 d比較根系及地上部分生長(zhǎng)狀況。

1.7 QZ-8菌株在田間土壤中的數(shù)量動(dòng)態(tài)變化

1）內(nèi)生菌抗生素標(biāo)記：通過對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行天然耐藥性檢測(cè)的結(jié)果選擇抗生素種類，本試驗(yàn)中，確定用氨芐西林作為QZ-8菌株的抗生素標(biāo)記。在含標(biāo)記藥物的培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)，直至確定菌株具有穩(wěn)定的耐藥性（QZ-8對(duì)氨芐西林的耐藥濃度達(dá)200 μg/mL）后進(jìn)行植株內(nèi)定殖試驗(yàn)。

2）將QZ-8菌株（4×108 cfu/mL）發(fā)酵液與茄子田塊土樣混合（按50 mL/kg比例），分裝在花盆中，每處理設(shè)3次重復(fù)。將花盆下部埋于田間，只留盆口暴露于地面，以不加QZ-8菌液的相同田塊土壤作為對(duì)照。于5、10、20、30、40、50、60 d分別取樣，采用稀釋平板法測(cè)量經(jīng)標(biāo)記的QZ-8在土壤中的存活數(shù)量，為菌株的田間應(yīng)用可行性提供依據(jù)。

1.8 QZ-8菌株在植株中的定殖

將茄子地土樣滅菌，裝缽（每缽裝2.5 kg土壤）后播種，每缽5粒種子，在光照12 h，28 ℃，濕度80%和黑暗12 h，24 ℃，濕度80%的變溫條件下培養(yǎng)；待茄子長(zhǎng)出2～3心葉時(shí)取已做標(biāo)記的QZ-8菌液（1×108 CFU/mL）澆灌于茄子根部，每株澆菌液10 mL，以不接菌的為對(duì)照，每個(gè)處理5缽，設(shè)3次重復(fù)。

在處理后的10、20、30、40、50 d，分別測(cè)定菌株的定殖情況：取植株根部及近地莖桿，去皮后稱重，表面消毒，充分剪碎，于25 ℃下用10 mL無菌水浸泡24 h后，取浸泡液稀釋后涂平板（篩選培養(yǎng)基，含氨芐西林200 μg/mL），計(jì)算茄子維管束中的菌含量（CFU/g）。

1.9 盆栽防治試驗(yàn)

盆栽土的制備：先將茄子地土壤與營(yíng)養(yǎng)土，按50∶50（質(zhì)量比）比例混合，然后按1 mL/kg比例接入黃萎病菌（50 cfu/mL孢子懸浮液），充分混勻后分裝于花盆中，以不接病菌的為對(duì)照。育苗后移栽，并且每株澆QZ-8菌液（1×108 CFU/mL）10 mL，每處理設(shè)3次重復(fù)；澆灌后30、45、60 d調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)。

防效=（對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對(duì)照組病情指數(shù)×100%

病情指數(shù)=[∑（病級(jí)株數(shù)×代表數(shù)值）/（總株數(shù)×發(fā)病最重級(jí)的代表數(shù)值）]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌的分離與篩選

經(jīng)分離純化后共得到210株細(xì)菌菌株。采用平板劃線法初篩得到18株抑菌活性較強(qiáng)的菌株，篩選率為8.6%；復(fù)篩結(jié)果顯示其中抑菌效果較好的菌株QZ-8，抑菌帶寬達(dá)24.00 mm，而對(duì)照不表現(xiàn)抑菌活性（圖1）。

2.2 QZ-8菌株對(duì)馬鈴薯的致病性及其對(duì)茄子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)的影響

1）初步致病性檢測(cè)結(jié)果表明，QZ-8對(duì)馬鈴薯無致病性，如圖2所示。

2）試驗(yàn)結(jié)果表明，各處理與對(duì)照之間的出芽率沒有明顯的區(qū)別，均為90%左右，但經(jīng)QZ-8菌株處理后的茄子種子在第3天開始發(fā)芽，而對(duì)照直到第5天時(shí)開始陸續(xù)發(fā)芽；QZ-8菌株處理后7 d的種子幼苗根系比對(duì)照明顯伸長(zhǎng)，長(zhǎng)度為15～35 mm，而對(duì)照根系長(zhǎng)僅有6～10 mm，如圖3、圖4所示。

3）經(jīng)QZ-8菌株處理后的茄子幼苗，在第30天調(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)其長(zhǎng)勢(shì)旺于對(duì)照，如圖5、圖6所示。處理的平均株高達(dá)到25.26 cm，對(duì)照僅為15.45 cm；植株根系發(fā)達(dá)，葉色濃綠，平均須根數(shù)目為96根，而對(duì)照為20根；植株莖的平均直徑為0.54 cm，對(duì)照為0.38 cm。

2.3 QZ-8菌株在田間土壤中的含量變化

試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。QZ-8菌株含量在接菌后0～10 d期間持續(xù)下降，之后維持10 d左右的穩(wěn)定期，其含量逐漸上升，第50天達(dá)到最高含量（3.2×105 CFU/g，此值與最初加入的菌含量相當(dāng)）；隨后又開始下降，但至60 d時(shí)仍有2.3×104 CFU/g的菌含量。對(duì)照則一直保持較低含量水平（1 000 CFU/g以下）。說明內(nèi)生拮抗菌株QZ-8在土壤中適應(yīng)一段時(shí)間后能夠繼續(xù)增殖。

2.4 QZ-8菌株在植株中的定殖情況

QZ-8菌株在植株中的定殖情況如圖8所示。從各處理的茄子根部維管束中均分離出了抗氨芐西林的細(xì)菌，且菌含量呈上升趨勢(shì)，在30 d左右達(dá)到高峰（3.1×105 CFU/g），之后緩慢下降，但在50 d時(shí)仍有2.7×105 CFU/g。對(duì)照處理只有少量抗氨芐西林菌落，含量在1 000 CFU/g以下。

2.5 盆栽試驗(yàn)

盆栽試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。經(jīng)QZ-8菌株處理后的茄子發(fā)病率和病情指數(shù)一直保持較低水平，平均發(fā)病率21.67%，平均病情指數(shù)10.42%，其防效可達(dá)到78.98%；而對(duì)照的平均發(fā)病率和平均病情指數(shù)分別達(dá)到79.44%和49.97%。且經(jīng)QZ-8菌株處理的茄子植株發(fā)病率和病情指數(shù)隨植株生長(zhǎng)發(fā)育均保持相對(duì)穩(wěn)定，而對(duì)照處理均有不斷加劇的趨勢(shì)。

3 討論

植物內(nèi)生菌是一個(gè)多樣性的微生物類群，已受到各國(guó)微生物界的高度關(guān)注。研究表明，植物內(nèi)生菌在體內(nèi)占據(jù)有利于生防的生態(tài)位，具有生物防治，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)宿主抗逆境、抗病蟲害、抗菌、抗病毒和抗腫瘤活性等優(yōu)點(diǎn)[4-6]。本研究從茄子根莖維管束內(nèi)篩選得到抑菌活性較強(qiáng)的菌株QZ-8，不僅在PSA平板上對(duì)茄子黃萎病菌表現(xiàn)出很高的活性，而且經(jīng)過致病性測(cè)定以及對(duì)茄子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)是否有影響的測(cè)試試驗(yàn)表明，該菌株對(duì)茄子安全，無副作用，并且還具有較強(qiáng)的促生作用。

對(duì)菌株在田間含量變化試驗(yàn)表明，QZ-8在田間狀態(tài)下能長(zhǎng)期存活（60 d）且保持較高菌含量。處理后前10 d的菌含量下降說明菌株本身對(duì)周圍環(huán)境有一個(gè)適應(yīng)過程，待穩(wěn)定后其菌群含量又呈上升趨勢(shì)，并達(dá)到峰值。這說明在一定的時(shí)空范圍內(nèi)，菌株喜好土壤中的某些營(yíng)養(yǎng)因子，能利用其進(jìn)行短時(shí)間的大量繁殖，隨著時(shí)間的推移，營(yíng)養(yǎng)因子消耗殆盡，菌群含量又表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，但在處理第60天菌含量仍然可達(dá)2.7×104 CFU/g，說明該菌株能在土壤中存活較長(zhǎng)時(shí)間。目前的研究已有關(guān)于內(nèi)生菌在茄子體內(nèi)的定殖消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的報(bào)道[7-10]，但少見相關(guān)的田間含量變化的報(bào)道。

QZ-8菌株定殖于茄子維管束內(nèi)，數(shù)量也呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。這與前人報(bào)道的結(jié)果不大一樣：居正英等[7]研究顯示，菌株29-12在茄子根內(nèi)11 d就檢測(cè)不到標(biāo)記菌株；吳藹民等[8]研究表明，內(nèi)生菌73a在不同抗性棉花品種內(nèi)的定殖也呈現(xiàn)由增到減的趨勢(shì)，但定殖時(shí)間也在10 d左右；陳利軍[9]研究表明，SC-bYM3-1內(nèi)生菌在油菜內(nèi)定殖后28 d仍能分離到（6.6×103 cfu/g）。分析認(rèn)為，這可能與菌株的種類和定殖能力有關(guān)。其次，在不同的生育期內(nèi)，其體內(nèi)會(huì)發(fā)生相應(yīng)的生理變化，其內(nèi)生菌的種群結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。這一點(diǎn)與很多研究報(bào)道相符[10-12]。盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，QZ-8菌株對(duì)茄子黃萎病具有很高的防效，達(dá)到78.98%，且發(fā)病率和病情指數(shù)保持相對(duì)穩(wěn)定，也可以說明QZ-8菌株對(duì)茄子黃萎病具有較穩(wěn)定的控制作用。

因此，該菌株是一個(gè)能有效定殖于茄子根部、并且較長(zhǎng)時(shí)間存活于田間土壤的內(nèi)生拮抗菌，具有進(jìn)一步開發(fā)成生防菌劑的價(jià)值；目前關(guān)于該菌株活性成分物質(zhì)的鑒定、分類地位、定殖機(jī)理、田間最佳定殖濃度以及在田間繁殖的影響因子等正在研究中。

參考文獻(xiàn)：

[1] ARSLAN M， DERVIS S. Antifungal activity of essential oils against three vegetative compatibility groups of Verticillium dahliae[J]. World J Microbiol Biotechnol，2010，26（10）：1813- 1821.

[2] SOESANTO L， TERMORSHUIZEN A J. Effect of temperature on the formation of microsclerotia of Verticillium dahliae [J]. J Phytopathol，2001，149：685-691.

[3] 劉富中，連 勇，陳鈺輝，等.“十五”期間我國(guó)茄子遺傳育種研究進(jìn)展[J].中國(guó)蔬菜，2006（3）：31-34.

[4] 賈 栗，陳疏影，翟永功，等.近年國(guó)內(nèi)外植物內(nèi)生菌產(chǎn)生物活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].中草藥，2007，38（11）：1750-1754.

[5] BENHAMOU N， KLOEPPER J W， Quadt-Hallman A， et al. Induction of defense related ultrastrurual modifications in pea root tissues inoculated with endophytic bacteria [J]. Plant Physiology，1996，112：919-929.

[6] 孫力軍，陸兆新，別小妹，等.1株抗菌植物內(nèi)生菌EJH-2菌株的分離和鑒定[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2006，18（1）：23-26.

[7] 居正英.茄子內(nèi)生枯草芽袍桿菌Bacillus subtilis 29-12防病促生生理生化研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2008.

[8] 吳藹民，顧本康，傅正擎，等.內(nèi)生菌73a在不同抗性品種棉花體內(nèi)的定殖和消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，2003，33（4）：292-293.

[9] 陳利軍.油菜內(nèi)生菌生物多樣性及其在宿主體內(nèi)消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2004.

[10] 宋子紅，丁立孝，馬伯軍，等.花生內(nèi)生菌的種群及動(dòng)態(tài)分析[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1999，24（4）：311-312.

[11] 游見明.茶樹中內(nèi)生菌的動(dòng)態(tài)分布[J].廣西植物，2008，28（1）：82-85.

[12] 史應(yīng)武，婁 愷，李 春.天山北坡甜菜內(nèi)生菌分離鑒定及其動(dòng)態(tài)變化[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，29（5）：2374-2382.