摘要：研究了廣林九號(hào)桉[Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis（Guanglin 9）]葉精油的抑菌活性。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析桉葉精油的化學(xué)成分，采用濾紙片法評(píng)價(jià)其抑菌活性，以平板稀釋法測(cè)定了精油的最小抑菌濃度。廣林九號(hào)桉葉精油的主要成分有：1，8-桉葉油素（40.844%）、α-蒎烯（24.221%）、α-松油醇（4.661%）、反式-松香芹醇（3.735%）、龍腦（2.762%）、乙酸α-松油脂（3.592%）和松香芹酮（1.978%）。廣林九號(hào)桉葉精油對(duì)測(cè)試的菌種均有良好的抑菌活性，但對(duì)細(xì)菌和霉菌的抑菌效果有所差異。對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli），黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）和橘青霉（Penicillum citrinum）的最小抑菌濃度分別為10、20、20、10、10、5 mL/L。

關(guān)鍵詞：廣林九號(hào)桉[Eucalyptus Urophylla×Eucalyptus Grandis（Guanglin 9）]葉；精油；抑菌活性；最小抑菌濃度

中圖分類號(hào)：TQ654+.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）21-5193-03

Studies on Antimicrobial Activity of Essential Oil from Leaves of Eucalyptus urophylla × Eucalyptus grandis （Guanglin 9）

TIAN Yu-hong1，ZHOU Qi1，PO Jun-hua2，MENG Lu-li1，LI Zi1

（1. Department of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Technology，Liuzhou 545006，Guangxi，China；

2. Liuzhou Huali Household Products Limited Company， Liuzhou 545006，Guangxi，China）

Abstract： The antimicrobial activity of the essential oil from leaves of Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis （Guanglin 9） was studied. The essential oil was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） method. The antimicrobial activity of oil was evaluated by using filter paper method and the minimum inhibitory concentration（MIC） was determined by plate dilution method. The main components of the essenti-al oil were 1，8-cineole（40.844%）， followed by α-pinene （24.221%）， α-terpineol（4.661%）， α-terpinyl acetate（3.592%）， borneol （2.762%）， trans-pinocarveol （3.735%） and pinocarvone（1.978%）. The results indicated that the essential oil had excellent antimicrobial activity against tested microorganisms. The effects of essential oil on antibacterial and antifungal activities differed obviously. The minimum inhibitory concentrations （MICs） were 10，20，20，10，10 and 5 mL/L for Staphylococus aureus， Bacillus subtilis， Escherichia coli， Aspergillus flavus， Aspergillus niger and Penicillum citrinum， respectively.

Key words： Eucalyptus urophylla × Eucalyptus grandis （Guanglin 9）； essential oil； antimicrobial activity； minimum inhibitory concentration

廣西是國(guó)家速生桉商品林基地的主要區(qū)域，廣林九號(hào)桉[Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis（Guanglin 9）]是廣西優(yōu)質(zhì)速生桉品種，具有速生、干直、耐寒等優(yōu)良特性，近幾年在廣西得到了大范圍的推廣種植。目前廣林九號(hào)桉的作用還只是木材，砍伐后剩余的枝葉僅被簡(jiǎn)單地用做燃料，大量的桉葉精油資源被浪費(fèi)，影響桉樹的綜合經(jīng)濟(jì)效益的提高。桉葉是中國(guó)南方常用的中草藥，桉葉油具有抗菌、抗炎、抗氧化和局部麻醉等作用，可用于治療流行性感冒、上呼吸道感染、肺炎、咳嗽及皮膚疾病[1-4]。目前有關(guān)廣林九號(hào)桉葉精油的生物活性的研究還鮮見報(bào)道，本試驗(yàn)對(duì)廣林九號(hào)桉葉精油的抑菌活性進(jìn)行了研究，為科學(xué)開發(fā)利用廣林九號(hào)桉葉提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 廣林九號(hào)桉葉樣品于2011年2月采自廣西國(guó)營(yíng)沙塘林場(chǎng)，隨機(jī)在10～15棵廣林九號(hào)桉樹上采集葉片樣品，將樣品置于陰涼處風(fēng)干后備用。

1.1.2 菌種 金黃色葡萄球菌（Staphylococus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli），黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）和橘青霉（Penicillum citrinum），由廣西工學(xué)院生物與化學(xué)工程系微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 儀器 6890GC/5973MS型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫科技公司），LRH-250-Ⅱ型全自動(dòng)新型生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠），SW-CJ-1B型標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），DMB5型Motic數(shù)碼顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)有限公司），HZ-9212S型恒溫培養(yǎng)振蕩器（太倉(cāng)市科教器材廠），628B-2型立式壓力蒸汽消毒器（遼寧省鐵嶺市醫(yī)療器械總廠）。

1.2 方法

1.2.1 廣林九號(hào)桉葉精油的提取 將風(fēng)干的桉葉葉片切成1～2 cm2的碎片，稱取100 g上述樣品置于揮發(fā)油提取器中按常規(guī)水蒸氣蒸餾法提取6 h，靜置分層后讀取揮發(fā)油的體積，所得廣林九號(hào)桉葉油為具有濃郁特殊嗅味的淡黃綠色油狀物。

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜工作條件

1）氣相色譜條件。毛細(xì)管色譜柱HP-5MS（30 m ×0.25 mm×0.25 μm）。升溫程序?yàn)?0 ℃保持1 min，以2 ℃/min的升溫速度升至170 ℃，再以8 ℃/min的升溫速度升至270 ℃，270 ℃保持5 min。載氣為高純氦氣。進(jìn)樣口溫度280 ℃，檢測(cè)器溫度230 ℃，分流比100∶1。

2）質(zhì)譜條件。EI電離源，電子能量70 eV，電子倍增器電壓1.5 kV， 質(zhì)量掃描范圍33～550 amu，全掃描方式。

1.2.3 廣林九號(hào)桉葉精油的抑菌活性研究

1）抑菌活性的測(cè)定。采用濾紙片法測(cè)定廣林九號(hào)桉葉精油的抑菌活性[5，6]。取吸水力較強(qiáng)且質(zhì)地均勻的濾紙，用打孔器打成直徑6 mm的圓形濾紙片，置潔凈干燥的培養(yǎng)皿中，干熱滅菌后備用。吸取0.2 mL已稀釋到一定濃度的各種菌液（細(xì)菌為108 CFU/mL，霉菌為106 CFU/mL），將其均勻地涂布于固體平板培養(yǎng)基表面，細(xì)菌為營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA），霉菌為PDA培養(yǎng)基。將一片滅過菌的濾紙片放于含菌平板上，再吸取10 μL廣林九號(hào)桉葉精油垂直加到濾紙片上。細(xì)菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，霉菌在28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察抑菌情況，并測(cè)量抑菌圈直徑。以常用抗生素（細(xì)菌用1.0 mg/mL的阿莫西林溶液，霉菌用0.27 mg/mL的克霉唑溶液）作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣，并重復(fù)2次。取試驗(yàn)結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果。

2）最小抑菌濃度的測(cè)定。采用平板連續(xù)稀釋法[7，8]。用經(jīng)滅菌處理的1% Tween 80 去離子水溶液，將待測(cè)精油配成不同濃度的藥液。將藥液與培養(yǎng)基（細(xì)菌為NA培養(yǎng)基，霉菌為PDA培養(yǎng)基）充分混勻后取15 mL加入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，得到含精油濃度分別為80.000、40.000、20.000、10.000、5.000、2.500、1.250、0.625 mL/L的培養(yǎng)基。吸取制備好的菌懸液或孢子懸液0.1 mL，將其均勻涂布于上述平板表面，置于一定溫度（細(xì)菌37 ℃、霉菌28 ℃）下，培養(yǎng)一定時(shí)間（細(xì)菌培養(yǎng)24 h，霉菌培養(yǎng)48 h）后，觀察供試菌的生長(zhǎng)情況。以完全沒有菌生長(zhǎng)的精油濃度作為最小抑菌濃度。以常用抗生素（細(xì)菌用阿莫西林，霉菌用克霉唑）作為陽(yáng)性對(duì)照，3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣林九號(hào)桉葉精油化學(xué)成分

廣林九號(hào)桉陰干葉的精油提取率為0.52 mL/100 g。對(duì)廣林九號(hào)桉葉精油進(jìn)行成分分析，采用計(jì)算機(jī)對(duì)各峰質(zhì)譜圖進(jìn)行NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索，根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行核對(duì)，參考標(biāo)準(zhǔn)圖譜及相關(guān)文獻(xiàn)確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)[3，9]。利用峰面積歸一法計(jì)算各組分的相對(duì)百分含量，經(jīng)鑒定確認(rèn)了56個(gè)化學(xué)成分，占總離子流出峰面積的94.378%。廣林九號(hào)桉葉精油化學(xué)成分見表1。由表1可知，廣林九號(hào)桉葉精油主要成分為1，8-桉葉油素（40.844%）、α-蒎烯（24.221%）、α-松油醇（4.661%）、反式-松香芹醇（3.735%）、乙酸α-松油脂（3.592%）、龍腦（2.762%）、松香芹酮（1.978%）、莰烯（1.164%）、α-龍腦烯醛（1.112%）、葑醇（1.104%）、斯巴醇（1.054%）和藍(lán)桉醇（1.036%）。

2.2 廣林九號(hào)桉葉精油的抑菌活性

廣林九號(hào)桉葉精油對(duì)供試菌種的抑菌圈直徑參見表2。由表2可知，廣林九號(hào)桉葉精油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、黃曲霉、黑曲霉和橘青霉均有較好的抑制作用。精油對(duì)上述供試菌抑菌圈的大小依次為16.8、13.0、9.5、9.7、11.7和17.5 mm。

2.3 廣林九號(hào)桉葉精油的最小抑菌濃度

采用平均連續(xù)稀釋法測(cè)定了廣林九號(hào)桉葉精油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、黃曲霉、黑曲霉和橘青霉的最小抑菌濃度，結(jié)果見表3。從表3可以看出，廣林九號(hào)桉葉精油對(duì)細(xì)菌和霉菌的抑菌效果有差異。對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌3種細(xì)菌的最小抑菌濃度為10～20 mL/L，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，最小抑菌濃度為10 mL/L。對(duì)黃曲霉、黑曲霉和橘青霉3種霉菌的最小抑菌濃度為5～10 mL/L，精油對(duì)橘青霉抑制作用最強(qiáng)，最小抑菌濃度為5 mL/L。

3 小結(jié)

廣林九號(hào)桉葉精油主要成分為1，8-桉葉油素（40.844%）、α-蒎烯（24.221%）、α-松油醇（4.661%）、反式-松香芹醇（3.735%）、乙酸α-松油脂（3.592%）、龍腦（2.762%）、松香芹酮（1.978%）、莰烯（1.164%）、α-龍腦烯醛（1.112%）、葑醇（1.104%）、斯巴醇（1.054%）和藍(lán)桉醇（1.036%）。

抑菌活性研究表明，廣林九號(hào)桉葉精油對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、黃曲霉、黑曲霉和橘青霉均具有抑菌活性，其對(duì)霉菌的抑制效果要強(qiáng)于對(duì)細(xì)菌的抑制效果。廣林九號(hào)桉葉精油在醫(yī)藥、食品及日化工業(yè)具有一定的應(yīng)用開發(fā)潛力。

參考文獻(xiàn)：

[1] 田玉紅，張祥民，黃泰松，等.桉葉油的研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（10）：139-143.

[2] EI-MONEIM M A A， FATMA S A， TURKY A F. Control of Tetranychus urticae Koch by extracts of three essential oils of chamomile， marjoram and Eucalyptus[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine，2012，2（1）：24-30.

[3] KUMAR P， SAPNA M， MALIK A， et al. Compositional analysis and insecticidal activity of Eucalyptus globulus （family： Myrtaceae） essential oil against housefly （Musca domestica）[J]. Acta Tropica，2012，122（2）：212-218.

[4] TOLOZA A C， LUCIA A， ZERBA E， et al. Interspecific hybridization of Eucalyptus as a potential tool to improve the bioactivity of essential oils against permethrin-resistant head lice from Argentina[J]. Bioresource Technology，2008，99（15）： 7341-7347.

[5] TYAGI A K，MALIK A. Antimicrobial potential and chemical composition of Eucalyptusglobulus oil in liquid and vapour phase against food spoilage microorganisms[J]. Food Chemistry， 2011，126（1）：228-235.

[6]王同禹，田玉紅，周小柳.八角茴香水溶性揮發(fā)成分的抑菌活性研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2010，35（6）：46-49.

[7] CANDAN F， UNLU M，TEPE B， et al. Antioxidant and antimicrobial activity of the essential oil and methanol extracts of Achillea millefolium subsp. Millefolium Afan. （Asteraceae）[J]. Journal of Ethnopharmacology，2003，87（2-3）：215-220.

[8] VASILIKI P， PROKOPIOS M，IOANNA C， et al. Volatiles with antimicrobial activity from the roots of Greek Paeonia taxa[J]. Journal of Ethnopharmacology，2002，81（1）：101-104.

[9] LI H， MADDEN J L，POTTS B M. Variation in volatile leaf oils of the Tasmanian Eucalyptus Species II. Subgenus Symphyomyrtus[J]. Biochemical Systematics and Ecology，1996，24（6）： 547-569.