摘要：收集轉(zhuǎn)外源抗蟲基因Cry1C*的HiII玉米材料T1代陽性轉(zhuǎn)化單株花粉，與生產(chǎn)上常用的鄭58、248、Ye478、昌7-2等30多份自交系測(cè)交和回交，并經(jīng)200 mg/L的草胺膦噴施、PCR檢測(cè)、大田鑒定等方法對(duì)后代植株進(jìn)行陽性單株篩選，連續(xù)進(jìn)行5次回交和篩選，最終自交純合獲得含Cry1C*基因抗蟲玉米新系32份。

關(guān)鍵詞：玉米；轉(zhuǎn)抗蟲基因；新種質(zhì)創(chuàng)制

中圖分類號(hào)：S513；S336 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）21-5137-03

Breeding of New Maize Germplasm with Borer Resistance

ZHANG Shi-long1，HE Zheng-hua1，Qiu Fa-zhan2，HUANG Yi-qin1

（1.Food Crops Institute， Hubei Academy of Agriculture Science，Wuhan 430064，China；

2. College of Plant Science Technology， Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

Abstract： Breeding new borer-resistant varieties was an effective method to prevent pests of maize. The pollens from T1 positive plants of HiII transformed with borer-resistant gene Cry1C* through particle gun bombardment were collected to pollinate more than 30 important inbreds such as Zheng58， 248， Ye478， Chang7-2 and so on， and then backcrossed with these inbreds as recurrent parents. Subsequently， the positive plants were obtained by 200 mg/L phosphinothricin screening， PCR validation and field identification. After continuous backcrossing and screening for 5 times， 32 new borer-resistant lines with Cry1C* gene were bred by final selfing.

Key words： maize； transforming insect-resistant gene； creation of new germplasm

玉米螟是我國玉米主要害蟲之一， 在我國的華北、東北、華東及西北危害嚴(yán)重。玉米螟可危害玉米植株地上的各個(gè)部位，使受害部分喪失功能。通常春玉米的受害株率為30%左右，減產(chǎn)10%。夏玉米受害較重，一般減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)，被害株率達(dá)到90%，減產(chǎn)30%左右[1]。由于近年玉米種植面積擴(kuò)大、 新品種生育期延長(zhǎng)、種植密度增加以及氣候等原因，玉米螟危害呈現(xiàn)逐年嚴(yán)重趨勢(shì)，經(jīng)濟(jì)損失較大[2]。

生產(chǎn)實(shí)踐表明，創(chuàng)制抗蟲玉米新種質(zhì)進(jìn)而選育抗蟲新品種是解決玉米螟危害的有效途徑。然而，傳統(tǒng)育種手段存在周期長(zhǎng)、抗源匱乏、雜交不育等難以克服的弊端。近年來，隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗螟品種（系）已成為控制玉米螟危害的一種重要手段[3，4]。據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）統(tǒng)計(jì)，2011年全球轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的種植面積達(dá)到4 330萬hm2，占全球玉米種植面積的27.2%[5]。

本研究擬將與抗除草劑Bar基因緊密連鎖的外源抗蟲基因Cry1C*轉(zhuǎn)入鄭58、248、Ye478、昌7-2等生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛的多份自交系中，創(chuàng)制一批抗蟲自交系，為選育抗蟲玉米新品種提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所采用玉米材料為鄭58、248、Ye478、昌7-2、豫82、4866、5AD、B73、M54、V190、V191、R060、 HZ111、HZ127、VA0301、VA0302、VA0303、A3566、DN6、DN9、CML50、GEMS16、CML103、W043、F06、8317、BN486、Z069、520、CML17、F11055、F11057、F11059、F11061、F11063、F11065等，均為生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛的自交系。轉(zhuǎn)外源抗蟲基因Cry1C*的HiII 玉米材料T1代陽性轉(zhuǎn)化單株花粉由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取與濃度檢測(cè) 玉米基因組DNA提取采用改良的CTAB法[6]，使用UV-2102 PC型紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度，并將其稀釋為20 ng/μL備用。

1.2.2 目的基因PCR擴(kuò)增引物序列及反應(yīng)程序 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列及PCR反應(yīng)程序見表1。

1.2.3 典型自交系的轉(zhuǎn)化 收集轉(zhuǎn)外源抗蟲基因Cry1C*的HiII玉米材料T1代陽性轉(zhuǎn)化單株花粉，與生產(chǎn)上常用的鄭58、248、Ye478、昌7-2等30多份玉米自交系測(cè)交。

1.2.4 200 mg/L草胺膦初步篩選及PCR鑒定 將測(cè)交所獲得的種子播種在苗圃中，待苗長(zhǎng)到3～4片葉時(shí)，用200 mg/L草胺膦噴霧[7]，保留耐受除草劑的植株，移栽至大田。提取存活植株幼嫩葉片DNA，用特定引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，確定含有抗蟲基因Cry1C*的陽性植株。

1.2.5 抗蟲鑒定 采用田間自然感蟲的方法[8]。在自然狀態(tài)下，將陽性抗蟲植株（GM）作好標(biāo)記，與對(duì)應(yīng)的輪回親本植株隨機(jī)混種，除了不噴施防治螟蟲的農(nóng)藥外，其他管理措施同大田玉米。在玉米整個(gè)生長(zhǎng)周期中觀察、比較抗蟲植株與輪回親本植株的抗蟲表現(xiàn)。挑選出無任一地上器官遭受螟蟲危害的陽性單株進(jìn)入下一輪的回交。

1.2.6 典型抗蟲系的獲得 以通過200 mg/L草胺膦初選、PCR檢測(cè)、田間鑒定而獲得的陽性單株為母本，再次與對(duì)應(yīng)的輪回親本回交，收獲種子后，將種子播種在苗圃中，待玉米苗長(zhǎng)到3～4片葉時(shí)，進(jìn)入“200 mg/L草胺膦初選—PCR檢測(cè)—田間鑒定”程序，所得到的陽性單株進(jìn)行下一輪的回交和鑒定過程。在BC5代，將得到的陽性單株自交純合，最終獲得穩(wěn)定的抗蟲新系。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)交、回交后代的除草劑初選結(jié)果

測(cè)交后代種子播種在苗圃中，待植株長(zhǎng)到3～4片葉時(shí)，噴灑200 mg/L的草胺膦，7 d后，一部分玉米苗葉片、莖稈萎蔫乃至整株呈現(xiàn)水漬狀，最終枯死；而另一部分則正常生長(zhǎng)，對(duì)草胺膦具有明顯的抗性（圖1）。由于外源抗蟲基因Cry1C*導(dǎo)入時(shí)搭載有與之緊密連鎖的抗除草劑Bar基因，因此，耐草胺膦的單株意味著可能含有抗蟲基因，是陽性單株。

2.2 轉(zhuǎn)化體的PCR鑒定結(jié)果

抽提玉米耐草胺膦單株葉片DNA，用特定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，絕大部分泳道均在近500 bp的位置有一條亮帶，少數(shù)泳道無帶（圖2）。存在特異條帶泳道所對(duì)應(yīng)的單株是陽性單株，含有Cry1C*基因。無特異條帶泳道所對(duì)應(yīng)的單株不含有Cry1C*基因而具有耐草胺膦的特性，可能是噴灑草胺膦不均勻所致，抑或該單株本身對(duì)除草劑具有較強(qiáng)的耐受性。

2.3 田間抗蟲鑒定結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，在自然感蟲狀態(tài)下，從苗圃中移栽到大田的絕大多數(shù)輪回親本植株被螟蟲危害，而經(jīng)除草劑初選、PCR檢測(cè)確定為陽性的單株絕大部分具有顯著的抗蟲效果（圖3）。少數(shù)陽性單株也遭到危害，可能的原因是目的基因表達(dá)量過低而起不到殺蟲效果，抑或目的基因處于“沉默”狀態(tài)。

2.4 抗蟲玉米新材料的獲得

經(jīng)過連續(xù)5代回交、200 mg/L草胺膦初選、PCR檢測(cè)及大田鑒定，最后自交純合后獲得含Cry1C*基因抗蟲玉米新系32份。所獲得的新系除在抗蟲性狀上與輪回親本有顯著差異外，在其他個(gè)別農(nóng)藝性狀也存在極微小的差別。

3 結(jié)論與討論

植物細(xì)胞是一個(gè)平衡體系， 進(jìn)入一個(gè)外源基因必然會(huì)擾亂其固有的平衡，在達(dá)到一個(gè)新的平衡前，細(xì)胞會(huì)動(dòng)用各種酶系統(tǒng)以及其他排異措施將外源基因大量產(chǎn)生的非必需產(chǎn)物進(jìn)行清除或初步降解再利用，這極有可能使外源基因處于極低表達(dá)量或“沉默”狀態(tài)[9]。本研究中，對(duì)經(jīng)除草劑草胺膦篩選、PCR檢測(cè)所獲得的陽性植株仍進(jìn)行田間鑒定，即是基于對(duì)已整合進(jìn)玉米基因組的外源基因是否表達(dá)、如何表達(dá)以及表達(dá)量多少的考慮。只有在田間生長(zhǎng)過程中表現(xiàn)出應(yīng)有的抗性才是真正的陽性植株，也才有實(shí)踐意義。

玉米抗螟蟲性能的鑒定一般有室內(nèi)喂蟲鑒定和田間接卵鑒定兩種方法[10-12]。由于外源抗蟲基因在玉米植株內(nèi)表達(dá)具有時(shí)空性，且玉米螟的危害具有周期長(zhǎng)、地上部所有器官均可危害等特點(diǎn)，使得上述鑒定方法出現(xiàn)明顯的不足。田間自然感蟲的鑒定方法雖然受環(huán)境因素影響，但它可以鑒定玉米任一地上器官在玉米整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)對(duì)螟蟲所有世代的抗蟲效果。由于要經(jīng)過連續(xù)5代的鑒定，并且嚴(yán)格遵循“任一器官有侵害癥狀該植株就淘汰”的篩選標(biāo)準(zhǔn)，從總體上看，能最大限度地保證選留的陽性植株具有好的抗蟲效果，所選出的抗蟲玉米新系能用于生產(chǎn)實(shí)踐。

參考文獻(xiàn)：

[1] 紀(jì)春學(xué).黑龍江省玉米螟的危害及防治技術(shù)[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2012（3）：135-136.

[2] 麥玉強(qiáng).玉米螟發(fā)生特點(diǎn)及綜合防治措施[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012（1）：184，186.

[3] 閆新甫.轉(zhuǎn)基因植物[M].北京：科學(xué)出版社，2003.

[4] WITKOWSKI J F，WEDBERG J L， STEFFEY K L， et al. Bt-corn and European corn borer： Long-term success through resistance management [M]. St Paul，MN： University of Minnesota Extension Service，1997.

[5] JAMES C. ISAAA Brief 43-Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops：2011[R]. Ithaca，NY：ISAAA，2011.

[6] 盧振宇，李明順，謝傳曉，等.玉米葉片DNA快速提取方法改進(jìn)研究[J].玉米科學(xué)，2008，16（2）：50-53，55.

[7] 王 琨，胡銀崗，楊政偉，等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)TLPD34基因的玉米遺傳轉(zhuǎn)化及檢測(cè)[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（5）：74-78.

[8] 吳全安.糧食作物種質(zhì)資源抗病蟲鑒定方法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1991.

[9] 柳小慶，陳茹梅.增強(qiáng)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的策略[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2012，14（1）：76-84.

[10] 劉 量，蘇海玲，湯繼華，等. 玉米 Bt 轉(zhuǎn)基因植株抗蟲性鑒定研究初報(bào)[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，33（3）：215-218.

[11] 劉宗華，胡彥民，湯繼華，等.回交二代玉米轉(zhuǎn)Bt基因材料抗蟲性鑒定研究[J].作物雜志，2000（2）：7-9.

[12] 周大榮，何康來.玉米螟綜合防治技術(shù)[M]. 北京：金盾出版社，1995.