摘要：根據(jù)GenBank中基因序列，利用DNAworks3.1軟件，選擇合適的參數(shù)優(yōu)化設(shè)計(jì)引物。通過一步簡單的重疊延伸PCR（OE-PCR），然后使用最外端的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到完整的基因序列。結(jié)果表明，利用該方法不但成功地合成了幾個具有畢赤酵母密碼子偏好性的基因，而且一次向野生型Cip基因里引入了12個點(diǎn)突變，并可以低成本、低錯誤率甚至是正確無誤地合成1.5 kb以內(nèi)的任何已知基因。

關(guān)鍵詞：基因合成；DNAworks3.1軟件；重疊延伸PCR（OE-PCR）

中圖分類號：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）12-2929-05

Study on Rapid Gene Synthesis Method by Overlap Extension（OE）-PCR

DONG Bing-xue1，HAN Xue-mei1，BI Shu-ping2，GENG San-chun1，LIU Wei1，LI Yun-hui1，ZHAN Hui-ying1

（1.School of Life Science and Technology， Nanyang Normal University， Nanyang 473061， Henan，China；

2. Dengfeng Animal Husbandry Bureau in Henan Province， Dengfeng 452470， Henan，China）

Absract： Optimized primers were designed according to the sequences of proteins searched from Genbank and parameters inputted using DNAworks3.1 program. Complete genes were obtained through a step of assembly multiple overlapping oligonucleotides by PCR to generatethe template DNA and a step of amplification of the template DNA sequence with the two outermost primers. The results showed that several genes with yeast codon bias had been synthesized successfully， 12 mutations were introduced simultaneously into Cip gene. This method enables DNA sequences with in sizes 1.5 kb be synthesized with few errors， eventually.

Key words： gene synthesis； DNAworks3.1 program； overlap extension（OE）-PCR

近年來，基因合成已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，例如生物大分子合成[1]，密碼子優(yōu)化[2]，DNA疫苗構(gòu)建[3]等。目前基因合成的方法有許多，如寡核苷酸連接法[4]、Fok I法[5]、自身引物PCR[6-8]、雙不對稱PCR（Dual asymmetrical PCR，DA-PCR）[9]、重疊延伸PCR（Overlap extension PCR，OE-PCR）[10]、模板指導(dǎo)的連接法（Template-directed ligation，TDL）[11]、等溫單向生長法[12]等。Stemmer等[10]報道的OE-PCR因簡單、快速而較為常用。OE-PCR使用長40 bp、互相重疊20 bp的寡核苷酸引物，通過一步簡單的重疊延伸PCR，然后用最外端的兩條引物進(jìn)行擴(kuò)增就可以得到完整的基因。然而這種方法并不適合所有的基因[13，14]，針對不同基因需要做不同的條件優(yōu)化。Young等[15]針對一步法OE-PCR技術(shù)的缺點(diǎn)，將雙不對稱PCR技術(shù)和OE-PCR技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展了一種稱為兩步法OE-PCR的技術(shù)，對所有的寡核苷酸都使用同一套設(shè)計(jì)方法，大大降低了基因拼裝過程中的錯誤。

本研究對OE-PCR進(jìn)行了一系列優(yōu)化，包括使用DNAworks 3.1軟件設(shè)計(jì)引物代替人工設(shè)計(jì)，控制引物長度在45 bp以下、使重疊區(qū)的解鏈溫度（Tm）高度相近、分散基因中集中A、T堿基；使用高保真的Primerstar HS DNA聚合酶代替Taq+Pfu DNA聚合酶，減少拼裝中的錯誤；提高退火溫度減少錯配和缺失；挑出錯誤最少的進(jìn)行校正等。利用該方法不但能夠低成本、低錯誤率甚至是正確無誤地合成1.5 kb以內(nèi)的任何已知基因，能夠同時向一個基因引入多個突變位點(diǎn)，而且能把功能相關(guān)的基因拼接成融合基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 限制性內(nèi)切酶、KOD-plus DNA聚合酶購自東洋紡（上海）生物科技有限公司，Taq、Pfu和Primerstar HS DNA聚合酶、DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限責(zé)任公司，化學(xué)藥品（分析純）購自生工生物工程（上海）股份有限公司，引物合成和測序由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限責(zé)任公司完成。

1.1.2 菌株質(zhì)粒 pUC19質(zhì)粒及大腸桿菌DH10B均由南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院保存。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中Mnp、Cip、Lac基因序列，使用DNAworks 3.1軟件（http：//helixweb.nih. gov.dnaworks）設(shè)計(jì)引物。根據(jù)表達(dá)需要在密碼頻率表中選擇宿主（試驗(yàn)中選擇了畢赤酵母）密碼子偏好性。參數(shù)設(shè)置為：引物長度（45 bp以下），重疊區(qū)解鏈溫度一般限制在58～70 ℃之間，其余的選擇默認(rèn)值；對基因內(nèi)部某些不利于克隆的限制性酶切位點(diǎn)予以去除，兩端可以根據(jù)需要添加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。

1.2.2 引物的合成 將合成的引物用無菌雙蒸水稀釋到100 mmol/L，同一個基因的幾十條寡核苷酸引物等量混合，稀釋至每條引物終濃度2 mmol/L配成混合引物。

1.2.3 不同DNA聚合酶進(jìn)行OE-PCR基因拼裝 每個基因拆分出的相鄰寡核苷酸引物在5′和3′端都有16～23 bp的重疊區(qū)，退火時組裝在一起，互為模板、引物，經(jīng)15～30個循環(huán)可組裝出完整的基因模板。本研究中3個待合成目的基因重疊區(qū)解鏈溫度相似，OE-PCR法拼裝基因時選用相同的體系和相似的條件。

1）Taq和Pfu DNA聚合酶混合拼裝基因。30 μL基因拼裝PCR反應(yīng)體系中含有2 μL混合引物，1× PCR Buffer，200 μmol/L dNTPs，0.75 U Taq DNA聚合酶和0.25 U pfu DNA聚合酶混合物。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，46 ℃退火2.5 min，72 ℃延伸n （n根據(jù)產(chǎn)物長短而定，下同）min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

2）KOD-plus DNA聚合酶拼接基因。30 μL基因拼裝PCR反應(yīng)體系中含有2 μL混合引物，1×PCR Buffer，200 μmol/L dNTPs，0.6 U Kod-plus DNA聚合酶。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火2 min，72 ℃延伸 1.0～1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

3）Primerstar HS DNA聚合酶拼接基因。30 μL基因拼裝PCR反應(yīng)體系中含有2 μL混合引物，1×PCR Buffer，200 μmol/L dNTPs，0.3 U Primerstar HS DNA聚合酶。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸 n min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

30 μL反應(yīng)體系含有1.5 μL第一輪拼裝PCR 產(chǎn)物作為模板，兩條最外端引物，1×PCR Buffer，200 μmol/L dNTPs，對應(yīng)的3種酶，反應(yīng)條件都選擇60 ℃退火45 s，其余條件分別對應(yīng)不同的酶反應(yīng)條件。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，試劑盒回收后，連接在Smal Ⅰ處理過的pUC19質(zhì)粒上，隨機(jī)挑選幾個陽性克隆送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限責(zé)任公司測序。

1.2.4 錯誤堿基的糾正 如果不能從3～5個隨機(jī)克隆中找到完全正確的目的基因，可以找一個錯誤最少的作模板，設(shè)計(jì)引物把待突變的位點(diǎn)放在引物的中間位置，用定點(diǎn)突變的方法糾正錯誤堿基；或者選用不同的克隆作為模板，擴(kuò)增出相應(yīng)位點(diǎn)的正確片段再用OE-PCR拼裝出正確基因。

1.2.5 基因內(nèi)多個位點(diǎn)的突變 向野生型Cip基因引入7個氨基酸突變位點(diǎn)（I49S、V53A、T121A、M166F、E239G、M242I和Y272F），參照“1.2.1”方法用DNAworks 3.1軟件設(shè)計(jì)引物，拆分后的引物內(nèi)含有12個點(diǎn)突變。使用Primerstar HS DNA聚合酶進(jìn)行基因拼裝和擴(kuò)增。

1.2.6 融合基因的拼裝擴(kuò)增 為保證融合蛋白中Cip和Mnp各自的正確折疊，在Cip基因的3′端和Mnp基因的5′端各加上6個脯氨酸。畢赤酵母偏好使用的脯氨酸密碼子為CCA，設(shè)計(jì)3′端加脯氨酸的Cip基因下游引物Cipr′：TGGTGGTGGTGGTGGTGGCAGCTCGAGTTATGGAGCTG；5′端加脯氨酸的Mnp基因上游引物Mnpf′：CCACCACCACCACCACCAGCGAATTCGCTGTTTGCCCAG，使兩個基因間有18 bp的重疊。以測序結(jié)果正確的Cip基因?yàn)槟０?，使用引物Cipf1（Cip基因的最外端上游引物GCGAATTCCAAGGTCCAGGTGGT，劃橫線的為酶切位點(diǎn)）和Cipr′擴(kuò)增出3′端帶有6個脯氨酸的Cip基因；以測序結(jié)果正確的Mnp基因?yàn)槟０?，使用引物Mnpf′和Mnpr26（Mnp的最外端下游引物TCCCCGCGGAGCAGGTCCATCAA）擴(kuò)增出5′端加6個脯氨酸的Mnp基因，再以Cipf1和Mnpr26作為引物，用OE-PCR的方法把Cip基因和Mnp基因拼裝成一個融合基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物設(shè)計(jì)對基因合成的影響

測序發(fā)現(xiàn)A、T堿基集中的地方容易有堿基缺失，引物過長也是造成堿基缺失的一個重要原因。Primerstar HS DNA聚合酶能在一定程度上改善由于引物過長造成的堿基缺失和錯配。對引物進(jìn)行了一系列調(diào)整：引物長度減短到45 bp以下；利用密碼子擺動性盡量使集中的A、T堿基分散；針對每一個基因，在58～70 ℃之間選擇不同的溫度，軟件會自動拆分出對應(yīng)的一套引物，在多套引物中選擇重疊區(qū)長度不小于12 bp、解鏈溫度相差不超過2 ℃、重復(fù)和錯配最少的一套引物用于基因拼裝。Cip基因被軟件拆分成50條40 bp長的引物，相鄰的寡核苷酸引物在5′和 3′端都有16～23 bp的重疊區(qū)，解鏈溫度59 ℃最合適；Mnp基因被拆分成52條40 bp長的引物，相鄰的寡核苷酸引物在5′和 3′端都有18～23 bp的重疊區(qū)，解鏈溫度60 ℃最合適；Lac基因被軟件拆分成58條45 bp長的引物，相鄰的寡核苷酸引物在5′和 3′端都有18～22 bp的重疊區(qū)，解鏈溫度60 ℃最合適。

2.2 不同DNA聚合酶對基因合成的影響

基因拼裝PCR中酶的選擇尤為重要，對于G、C堿基含量比較低的Cip基因和Mnp基因來說，3種酶都能合成出合適大小的片段，而對于G、C堿基含量比較高、片段比較長的Lac基因，只有Primerstar HS DNA聚合酶才能合成出合適大小的片段（圖1）。3種酶相比，Primerstar HS DNA聚合酶的擴(kuò)增性最強(qiáng)、保真性最高，拼裝Mnp和Cip基因使用Primerstar HS DNA聚合酶退火溫度最高可以為60 ℃，退火時間最短為1 min；而使用Taq+Pfu DNA聚合酶拼裝基因退火溫度最高只能為46 ℃，退火時間最短2.5 min；Kod-plus DNA聚合酶居二者之間；測序結(jié)果顯示Primerstar HS DNA聚合酶可以在很大程度上改善堿基的缺失。使用改良后的40～45 bp的寡核苷酸引物和Primerstar HS DNA聚合酶進(jìn)行拼裝的基因在3個克隆內(nèi)得到了完全正確的Cip基因，含有極少突變或者缺失的Mnp和Lac基因。錯誤位點(diǎn)通過簡單糾正就可以完成基因的合成。使用40～45 bp寡核苷酸時總引物堿基數(shù)是基因長度的約1.8～1.9倍，比59 nt引物的1.6倍合成引物的成本略高，但是錯誤率非常低，后續(xù)測序費(fèi)用大大降低。

2.3 錯誤堿基的糾正結(jié)果

如果不能從3～5個克隆中找出完全正確的目的基因，可以挑錯誤最少的基因作為模板，用定點(diǎn)突變的方法糾正錯誤堿基。對于Lac基因，挑選含有最少錯誤的1個克?。ㄒ粋€T到C的突變，一個G到A的突變）作為模板，用定點(diǎn)突變的方法糾正合成了一個Lac基因，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)序列完全正確。此外還嘗試用OE-PCR方法來糾正堿基錯誤。以3個含不同錯誤位點(diǎn)的Lac基因克隆為模板，分別擴(kuò)增出相應(yīng)的正確片段，再通過重疊區(qū)退火把正確的片段拼裝成完整的基因。用引物lacf1和lacr4擴(kuò)增出一個長219 bp的DNA片段，命名為LacA；用引物lacf4和引物lacr25擴(kuò)增出長1 147 bp的DNA片段，命名為LacB；用引物lacf25和lacr29擴(kuò)增出長272 bp的DNA片段，命名為LacC。然后把LacA、LacB和LacC用OE-PCR拼接成一個完整的Lac基因（圖2）。拼接后的基因連接在Smal Ⅰ處理過的pUC19載體上，測序結(jié)果顯示得到了完全正確的畢赤酵母密碼子偏好性的Lac基因。

2.4 基因內(nèi)多位點(diǎn)突變結(jié)果

使用DNAworks 3.1軟件設(shè)計(jì)引物，向野生型Cip基因里引入了7個氨基酸的突變（包括12個點(diǎn)突變），命名為Cipmt7；Primerstar HS DNA聚合酶作為基因拼裝擴(kuò)增用酶，經(jīng)過兩輪PCR擴(kuò)增到了合適大小的片段（圖3），測序顯示得到了完全正確的帶有12個點(diǎn)突變的基因。

2.5 融合基因的拼裝合成結(jié)果

改良后的基因合成方法適用于合成200～1 500 bp的基因，對于長度超過2 kb的基因，可以先合成1 kb左右的片段，再利用OE-PCR拼接成完整的基因。在Cip基因的3′端和Mnp基因的5′端各加上6個脯氨酸，使二者之間有18 bp的重疊。先分別擴(kuò)增出3′端帶有脯氨酸的Cip基因和5′端帶有脯氨酸的Mnp基因等摩爾混合作模板，再以Cipf1和Mnpr26作為引物，用OE-PCR的方法把二者拼裝成一個融合基因（圖4）。

3 小結(jié)與討論

利用改良的基因合成方法不但可以合成1.5 kb內(nèi)的序列已知的基因；對于長度超過2 kb的基因序列，可以先把基因拆成幾個1 kb左右的片段，再通過重疊區(qū)拼接成完整的基因，并可以對其序列進(jìn)行一系列改造，如限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的修飾、密碼子偏好性的改變等，以適用于不同宿主間的異源表達(dá)；對于突變的引入，尤其是有多個位點(diǎn)突變時這種方法遠(yuǎn)比定點(diǎn)突變快速、簡單、成本低廉。

OE-PCR因其簡單、成本相對較低而成為了一種非常受歡迎的基因合成方法。然而，這種方法錯誤率較高可能是因?yàn)镈NA聚合酶的保真性不高，退火溫度低，各重疊區(qū)的解鏈溫度差異大。為了解決這個問題，需要一個特殊的引物設(shè)計(jì)軟件，使重疊區(qū)解鏈溫度高度相似，消除各重疊區(qū)的解鏈溫度差異，除掉影響基因合成的二級結(jié)構(gòu)，DNAworks軟件就是具有高通量設(shè)計(jì)合成基因所需的寡核苷酸引物潛能的軟件。

改進(jìn)OE-PCR主要目的是降低合成的費(fèi)用，減少合成基因中的錯誤率?；蚝铣沙杀局饕▋刹糠?，一是引物的成本，主要和引物的長短有關(guān)；二是基于出錯率的測序成本。為了降低成本曾嘗試使用59 bp的引物，結(jié)果顯示所有的克隆都含有多個單堿基的缺失或者突變[16]。高質(zhì)量的聚合酶只能在一定程度上減少突變和缺失，卻不能改變引物過長造成的基因合成中的錯誤，其主要原因可能是引物合成過程中的隨機(jī)錯誤（比如不完全耦合，錯配等），其錯誤率大約為1～3個/kb[13，17，18]。隨著引物長度的增加，出錯的幾率也增大；引物使用越多，DNA序列的正確率也下降越多，因此推測縮短引物長度是解決突變的一個辦法。造成錯誤率高的另一個原因是不合適的反應(yīng)條件，包括退火溫度、聚合酶的保真性等。本研究中也進(jìn)行了相應(yīng)的調(diào)整，主要包括利用密碼子擺動性把集中分布的A、T堿基對在引物中拆散，提高退火溫度以降低堿基缺失，使用高保真度的Primerstar HS DNA聚合酶以減少基因合成中堿基的缺失和突變。利用改進(jìn)的方法擴(kuò)增后，從3～5個克隆中就能夠篩選到序列完全正確或者極少突變?nèi)笔У目寺　?/p>

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