摘要：為研究枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BLYS_1蛋白酶np基因在蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis）BMB171中的表達(dá)情況，從蘇云金芽孢桿菌T6中克隆了cry3A啟動(dòng)子的兩個(gè)片段，分別命名為pro3Aa和pro3Ab，并與pHT304質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒pHT304-3Aa-np和pHT304-3Ab-np，分別轉(zhuǎn)化蘇云金芽孢桿菌BMB171，得到重組菌BLYS-3Aa-np和BLYS-3Ab-np。結(jié)果表明，重組菌BLYS-3Ab-np發(fā)酵液中約110 ku的蛋白酶條帶亮度明顯高于重組菌BLYS-3Aa-np發(fā)酵液中對應(yīng)條帶亮度，BLYS-3Ab-np產(chǎn)蛋白酶能力明顯高于BLYS-3Aa-np，隨著發(fā)酵時(shí)間延長到60 h，對應(yīng)條帶的亮度均比45 h條帶弱，與發(fā)酵上清液中水解干酪素結(jié)果變化一致。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）；cry3A啟動(dòng)子；蛋白酶

中圖分類號(hào)：S432.4+2；Q812 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）12-2926-03

Expression of Protease np Gene of Bacillus subtilis in B. thuringiensis BMB171

WANG Hui-xing，LEI Zhen-zhen，XU Ke-jing，YUE Chao-yin

（Biotechnology Research Center，China Three Gorges University，Yichang 443002，Hubei，China）

Abstract： In order to study the expression of protease np gene of Bacillus subtilis in B. thuringiensis strain BMB171， two fragments of cry3A promoter were cloned and named as pro3Aa and pro3Ab. The two recombinant gene were inserted into shuttle vector pHT304， resulting two recombinant plasmid pHT304-3Aa-np and pHT304-3Ab-np. The recombinant plasmid were introduced into B. thuringiensis strain BMB171 respectively. The results showed that BLYS-3Ab-np had higher expression level of protease than BLYS-3Aa-np. With fermentation time extended to 60 h， the brightness of the bands were weaker than 45 h， consistent with fermentation supernatant hydrolyzed casein results.

Key words： Bacillus subtilis； B. thuringiensis； cry3A promoter； protease

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）殺蟲晶體蛋白基因cry3A啟動(dòng)子是一種不依賴芽孢形成的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在營養(yǎng)期啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，具有啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄時(shí)間早、轉(zhuǎn)錄時(shí)間長、轉(zhuǎn)錄活性高的特點(diǎn)。在不能形成芽孢的突變株中cry3A啟動(dòng)子能使基因表達(dá)量迅速提高， 表達(dá)期延長并在構(gòu)建芽孢桿菌表達(dá)載體時(shí)常被采用[1-3]。蛋白酶（Protease）是一類在適當(dāng)條件下能夠高效水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶，廣泛存在于枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等微生物中[4]。2009年本課題組從宜昌市土壤中分離得到一株枯草芽孢桿菌（B. subtilis）BLYS_1，其具有產(chǎn)堿性蛋白酶的活性。劉海軍[5]、樂超銀等[6]報(bào)道枯草芽孢桿菌BLYS_1發(fā)酵得到的大豆肽能增強(qiáng)小鼠抗疲勞能力和免疫能力，并具有良好的開發(fā)前景。

本研究通過克隆蘇云金芽孢桿菌cry3A啟動(dòng)子的兩個(gè)不同特征啟動(dòng)序列，將其與枯草芽孢桿菌BLYS_1蛋白酶np基因連接到穿梭質(zhì)粒pHT304中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pHT304-3Aa-np和pHT304-3Ab-np，并轉(zhuǎn)入蘇云金芽孢桿菌突變株BMB171中，得到兩株重組蘇云金芽孢桿菌BLYS-3Aa-np和BLYS-3Ab-np，為進(jìn)一步研究cry3A啟動(dòng)子的功能提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 枯草芽孢桿菌BLYS_1、蘇云金芽孢桿菌BMB171（無內(nèi)生質(zhì)粒突變株）、蘇云金芽孢桿菌T6（含cry3A啟動(dòng)子）、大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pHT304均由三峽大學(xué)生物技術(shù)中心保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）LB培養(yǎng)基：酵母膏5 g，NaCl 5 g，胰蛋白胨10 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH至7.2，1×105 Pa滅菌30 min；

2）干酪素培養(yǎng)基：干酪素1.5 g，大量元素（NaNO3 2.0 g/L，K2HPO4 1.5 g/L，CaCl2 0.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L） 10 mL，微量元素（FeSO4·7H2O 5.0 mg/L，MnSO4·7H2O 1.6 mg/L，ZnSO4·7H2O 1.4 mg/L，CoCl2 0.5 mg/L） 0.1 mL，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)pH至7.2，1×105 Pa滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基因組DNA的提取 提取枯草芽孢桿菌BLYS_1和蘇云金芽孢桿菌T6基因組DNA，方法參照文獻(xiàn)[7]。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[5，8，9]分別設(shè)計(jì)cry3A啟動(dòng)子和蛋白酶np基因的PCR擴(kuò)增引物，引物見表1。以枯草芽孢桿菌BLYS_1基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增蛋白酶np基因，以蘇云金芽孢桿菌T6基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增cry3A啟動(dòng)子。擴(kuò)增np基因反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性45 s，52 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增cry3A啟動(dòng)子兩個(gè)不同啟動(dòng)序列的反應(yīng)程序均為：94 ℃預(yù)變性10 min； 94 ℃變性60 s，42 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.3 重組質(zhì)粒pHT304-3Aa-np和pHT304-3Ab-np的構(gòu)建與鑒定 用PstⅠ/XbaⅠ分別雙酶切pHT304質(zhì)粒和cry3Aa啟動(dòng)子片段，4 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定，將陽性菌送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序正確的克隆命名為pHT304-3Aa；用Hind Ⅲ/XbaⅠ分別雙酶切pHT304質(zhì)粒和cry3Ab啟動(dòng)子片段，同法構(gòu)建重組質(zhì)粒pHT304-3Ab[10]。

用XbaⅠ/BamHⅠ分別雙酶切pHT304-3Aa質(zhì)粒、pHT304-3Ab質(zhì)粒和蛋白酶np基因，4 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆用引物np-F/R進(jìn)行PCR鑒定，將陽性菌送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序正確的克隆分別命名為pHT304-3Aa-np和pHT304-3Ab-np。

1.2.4 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化蘇云金芽孢桿菌BMB171 制備蘇云金芽孢桿菌BMB171電轉(zhuǎn)化感受態(tài)。將重組質(zhì)粒加入到100 μL 蘇云金芽孢桿菌BMB171電轉(zhuǎn)化感受態(tài)中，使質(zhì)粒DNA的濃度為10 ng/mL，將混合了重組質(zhì)粒的蘇云金芽孢桿菌BMB171電轉(zhuǎn)化感受態(tài)轉(zhuǎn)入0.1 cm Bio-Rad電擊杯進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。電脈沖參數(shù)設(shè)置為：脈沖場強(qiáng)1 100 V，脈沖時(shí)間1.0 ms，脈沖間隔時(shí)間 0.125 ms，脈沖次數(shù)3次[11]。脈沖結(jié)束后迅速向電擊杯中加入1 mL 的LB液體培養(yǎng)基，于30 ℃、190 r/min 搖床培養(yǎng)3 h，取菌液涂布含（25 μg/mL）的LB平板，30 ℃培養(yǎng)2 d，挑選陽性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，將陽性菌送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序正確的克隆分別命名為蘇云金芽孢桿菌BLYS-3Aa-np和BLYS-3Ab-np。

1.2.5 重組蘇云金芽孢桿菌BLYS-3Aa-np和BLYS-3Ab-np產(chǎn)酶試驗(yàn) 將重組蘇云金芽孢桿菌BLYS-3Aa-np和BLYS-3Ab-np分別接種于干酪素培養(yǎng)基，180 r/min、37 ℃培養(yǎng)，15、30、45和60 h分別取發(fā)酵液，于4 ℃、5 000 r/min離心5 min，收集上清液，各取100 μL加入到干酪素固體培養(yǎng)基上進(jìn)行水解試驗(yàn)，測定水解圈直徑；另各取30 μL進(jìn)行Native PAGE，以蘇云金芽孢桿菌BMB171發(fā)酵液45 h的上清液作對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 cry3A啟動(dòng)子分析

cry3Aa啟動(dòng)子全長為1 073 bp，經(jīng)分析該片段含有兩個(gè)啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)元件，1-503 bp片段為一個(gè)弱啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)區(qū)域，504-1 073 bp片段為一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子區(qū)域；cry3Ab啟動(dòng)子為cry3Aa啟動(dòng)子的504-1 073 bp片段，全長569 bp，該片段為強(qiáng)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)區(qū)域。

2.2 重組質(zhì)粒pHT304-3Aa-np和pHT304-3Ab-np鑒定結(jié)果

將pHT304-3Aa-np質(zhì)粒和pHT304-3Ab-np質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆進(jìn)行單菌落PCR檢測，PCR產(chǎn)物電泳見圖1。由圖1可知， 泳道1-6中同時(shí)出現(xiàn)融合基因cry3Aa-np（2 059 bp）和蛋白酶np基因（986 bp）條帶，pHT304-3Aa-np質(zhì)粒構(gòu)建成功并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α；泳道7-16中只有泳道14未見蛋白酶np基因條帶，其他泳道均同時(shí)出現(xiàn)融合基因cry3Ab-np（1 555 bp）和蛋白酶np（986 bp）基因條帶，pHT304-3Ab-np重組質(zhì)粒構(gòu)建成功并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α。

2.3 重組蘇云金芽孢桿菌BLYS-3Aa-np和BLYS-3Ab-np鑒定結(jié)果

將重組質(zhì)粒pHT304-3Aa-np和pHT304-3Ab-np分別電擊轉(zhuǎn)化蘇云金芽孢桿菌BMB171，挑選PCR陽性單菌落搖瓶培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果見圖2。從圖2中可以看出，從陽性轉(zhuǎn)化子中提取的質(zhì)粒經(jīng)酶切后均能得到對應(yīng)的目的條帶。將酶切正確的克隆進(jìn)行進(jìn)一步測序驗(yàn)證，獲得重組蘇云金芽孢桿菌BLYS-3Aa-np和BLYS-3Ab-np。

2.4 重組菌BLYS-3Aa-np和BLYS-3Ab-np產(chǎn)酶能力分析

重組菌發(fā)酵上清液水解干酪素的效果見圖3。從圖3中可以看出，前45 h隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，這兩種重組菌的發(fā)酵上清液水解干酪素的水解圈直徑也逐漸增大，重組菌BLYS-3Ab-np的45 h發(fā)酵上清液水解圈直徑最大，為15.4 mm（B3）；重組菌BLYS-3Aa-np在45 h的水解圈最大，為12.9 mm（A3），發(fā)酵時(shí)間超過45 h以后，產(chǎn)酶能力減弱，對應(yīng)的A4、B4水解圈明顯小于45 h的水解圈A3、B3。發(fā)酵液Native PAGE結(jié)果見圖4。從圖4中可以看出，發(fā)酵液中約110 ku的蛋白條帶亮度前45 h隨發(fā)酵時(shí)間的延長而增強(qiáng)，重組菌BLYS-3Ab-np發(fā)酵液中該蛋白條帶的亮度明顯高于重組菌BLYS-3Aa-np發(fā)酵液中對應(yīng)條帶亮度，表明BLYS-3Ab-np產(chǎn)蛋白酶能力明顯高于BLYS-3Aa-np的產(chǎn)酶能力。隨著發(fā)酵時(shí)間延長到60 h，對應(yīng)條帶的亮度均比45 h條帶弱，這與發(fā)酵上清液水解干酪素結(jié)果變化一致。

3 小結(jié)與討論

本研究經(jīng)過對cry3A 啟動(dòng)子序列分析，設(shè)計(jì)了兩對特異性引物成功地從蘇云金芽孢桿菌T6中擴(kuò)增出cry3A啟動(dòng)子的兩個(gè)不同含啟動(dòng)序列片段，以穿梭質(zhì)粒pHT304為載體，將擴(kuò)增的cry3A啟動(dòng)子兩個(gè)片段分別與BLYS_1蛋白酶np基因組成融合基因，并連接到pHT304質(zhì)粒上構(gòu)建了重組質(zhì)粒pHT304-3Aa-np和pHT304-3Ab-np。分別用重組質(zhì)粒pHT304-3Aa-np和pHT304-3Ab-np轉(zhuǎn)化蘇云金芽孢桿菌突變株BMB171，篩選得到重組蘇云金芽孢桿菌BLYS-3Aa-np和BLYS-3Ab-np。

發(fā)酵液Native PAGE和水解圈試驗(yàn)證明重組蘇云金芽孢桿菌BLYS-3Ab-np的產(chǎn)酶能力明顯高于BLYS-3Aa-np，BLYS-3Ab-np發(fā)酵液在干酪素平板上的水解圈直徑明顯大于BLYS-3Aa-np，表明pro3Ab啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力比pro3Aa啟動(dòng)子強(qiáng)。用cry3A-F1/cry3A-R引物擴(kuò)增的pro3Aa啟動(dòng)子片段包含有兩個(gè)啟動(dòng)子的特征結(jié)構(gòu)，其1-503 bp區(qū)域有一個(gè)弱啟動(dòng)子，504-1073 bp區(qū)域?yàn)閺?qiáng)啟動(dòng)子區(qū)域，從發(fā)酵產(chǎn)酶的結(jié)果分析，兩個(gè)啟動(dòng)子聯(lián)用并沒有增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的效果；pro3Aa啟動(dòng)子的504-1 073 bp區(qū)域與cry3A-F2/cry3A-R引物擴(kuò)增的pro3Ab啟動(dòng)子部分區(qū)域重疊，用pro3Ab啟動(dòng)子構(gòu)建的重組菌BLYS-3Ab-np產(chǎn)酶能力明顯高于為pro3Aa啟動(dòng)子構(gòu)建的重組菌BLYS-3Aa-np，結(jié)果表明pro3Ab啟動(dòng)子是cry3A啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄所必需的區(qū)域。

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