摘要：從玉龍雪山土壤樣品中分離出放線菌27株，進行抑菌活性、基因序列、基因簇分析和篩選。結(jié)果表明，玉龍雪山土壤樣品中的放線菌屬于Streptomyces、Rhodococcus屬，大部分菌株對金黃色葡萄球菌有抑菌活性，大多含有聚酮類化合物、非核糖體多肽合成基因，具有產(chǎn)生聚酮類化合物和非核糖體合成多肽活性產(chǎn)物的潛力。

關(guān)鍵詞：玉龍雪山；放線菌；分離；化合物合成基因

中圖分類號：Q93 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）12-2810-02

Study and Isolation of Actinobacteria from Jade Dragon Snow Mountain Soil

OUYANG Yong-chang，CHEN Ze-ping，OU Jun-hao

（Department of Biotechnology， Guangzhou Medical University， Guangzhou 510182， China）

Abstract： 27 strains of actinomycetes were isolated from soil samples collected from Jade Dragon Snow Mountain， Yunnan province by actinomycetes culture medium. Based on the PCR-RFLP of the 16 S rRNA genes， these isolates were divided into 7 groups， which were initially identified as genera Streptomyces and Rhodococcus by phylogenetic analysis. All isolates were screened for antimicrobial actives and genes encoding polyketide synthases（PKS） and nonribosomal peptide synthetases （NRPS）. The results showed that almost all isolates have PKS， NRPS genes and antimicrobial activities in indicators of Staphylococcus aureus.

Key words： Jade Dragon Snow Mountain； actinomycetes； isolating； synthesis genes of secondary metabolites

放線菌是一類重要的微生物資源，醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)中應(yīng)用的抗生素中有100多種來源于放線菌[1]，同時放線菌還能產(chǎn)生酶 （蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等）、維生素、有機酸等生物活性物質(zhì)[2]，具有巨大的利用價值。隨著研究的深入，為獲得獨特的放線菌資源，研究者從特殊環(huán)境和海洋中分離放線菌并研究其活性產(chǎn)物[3-5]。目前鮮見關(guān)于玉龍雪山土壤放線菌的研究報道，試驗從玉龍雪山土壤樣品中分離放線菌并對其抑菌活性和次生代謝產(chǎn)物的潛在產(chǎn)生能力進行研究。

1 材料和方法

1.1 材料

土壤樣品采自云南麗江玉龍雪山，采集地海拔4 550 m，植被為森林，采集距離地表土層2～3 cm的土壤。

1.2 放線菌的分離

取樣品10 g加入10 mL無菌水，充分振蕩混勻后取上清液連續(xù)進行10倍稀釋，取稀釋3、4、5次后的稀釋液 200 μL均勻涂抹于高氏培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～4周后進行放線菌分離，經(jīng)純化培養(yǎng)后進行下一步研究。

1.3 PCR-RFLP和進化分析

對分離純化的放線菌菌株進行DNA提取，提取方法按照文獻[6]。16 S rRNA基因分析的引物為27F（5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1500r（5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′），其PCR體系參照文獻[7]。利用HhaⅠ酶切進行RFLP分析，反應(yīng)體系為HhaⅠ 0.2 U、PCR產(chǎn)物3 μL、ddH2O和酶切Buffer補齊至20 μL，酶切3 h后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切類型。從每個酶切類型中選取1個代表菌株，將其16 S rRNA基因的PCR產(chǎn)物送Invitrogen上海公司測序，測序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫并與其他序列進行比對，利用MEGA4.0軟件Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[7]。

1.4 抑菌活性的測定

指示菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）。抑菌圈大于1 mm則認為目的放線菌有抑制指示菌的活性（陽性），若小于1 mm則認為目的放線菌沒有抑制指示菌的活性（陰性）。

1.5 PKS和NRPS合成基因的檢測

利用PCR方法篩選目的菌是否有聚酮類化合物（PKS）Ⅰ型、Ⅱ型和非核糖體合成多肽（NRPS）化合物的合成基因，引物序列PCR方法和過程參照文獻[8]。含合成基因記為陽性，不含合成基因記為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌的分離與鑒定結(jié)果

從樣品中共分離純化出27株具有放線菌形態(tài)的菌株。利用引物從所有分離的菌株中得到了其16S rRNA基因擴增產(chǎn)物。基于HhaⅠ酶切的PCR-RFLP分析顯示有7種不同的酶切類型（圖1）。7個代表菌株測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果見表1，構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹如圖2。株菌分別屬于放線菌目的Streptomyces、Rhodococcus屬。

2.2 放線菌抑菌活性測定結(jié)果

放線菌抑菌活性測定結(jié)果（表1）表明，放線菌的抑菌活性與16S rRNA基因的PCR-RFLP分組呈現(xiàn)對應(yīng)關(guān)系，相同的PCR-RFLP分組表現(xiàn)出相似的抑菌活性。大部分放線菌對金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌活性、對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌沒有明顯的抑菌活性。

2.3 PKS和NRPS合成基因檢測結(jié)果

PKS和NRPS合成基因片段分析結(jié)果（表1）可見，除菌株A5和A6外，其他5個樣品都含有PKSⅠ合成基因；菌株A6、B8和B9含有PKSⅡ合成基因，除菌株A6和B9外，其他放線菌都有NRPS合成基因；利用PKS和NRPS合成基因片段檢測結(jié)果可分析放線菌產(chǎn)生這兩類物質(zhì)的潛力，具有相應(yīng)基因則具有產(chǎn)生相關(guān)活性物質(zhì)的潛力。

3 小結(jié)與討論

試驗從玉龍雪山土壤樣品中分離得到了27株放線菌，可分為7種不同酶切類型，初步鑒定屬于Streptomyces、Rhodococcus屬。這些放線菌與高原土壤放線菌類似[9]，能產(chǎn)生抑菌活性產(chǎn)物，大多數(shù)菌株對金黃色葡萄球菌有抑菌作用。

聚酮化合物是一類重要的次級代謝產(chǎn)物，具有重要的商業(yè)價值[10]。本研究結(jié)果表明，所采集的玉龍雪山土壤樣品中的放線菌大部分菌株有潛在的產(chǎn)生PKS和NRPS化合物的能力。Rhodococcus被認為是產(chǎn)生新抗生素的生物資源[11]，試驗分離到的Rhodococcus菌株（B12），表現(xiàn)出對大腸桿菌有抑菌活性、含有PKS和NRPS合成基因，該菌值得進一步研究。在菌株B9的進化分析過程中發(fā)現(xiàn)與菌株Streptomyces sp. GW25-12（GenBank： EF471902.1）相似性很高，提示它可能具有纖維素降解能力。后續(xù)試驗利用纖維素-剛果紅培養(yǎng)基也初步證實菌株B9確實具有較好的纖維素酶活性，具體特性有待進行深入研究。

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