摘要：從采自秦嶺的森林腐木菌苔上分離到一株產(chǎn)漆酶的裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.） 菌株mys005，對其產(chǎn)漆酶培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)。結(jié)果表明，裂褶菌菌株mys005的產(chǎn)漆酶適宜培養(yǎng)方式為液體淺層振蕩培養(yǎng)，含有Cu2+、Mn2+、Zn2+的微量元素復(fù)合液、洋蔥（Allium cepa L.）、麥（Triticum aestivum L.）麩對其產(chǎn)漆酶都有較大的促進(jìn)作用，而愈創(chuàng)木酚則對其生長和產(chǎn)漆酶有抑制作用。由新鮮馬鈴薯（Solanum tuberosum L.） 200 g、K2HPO4 1.00 g、NaCl 0.50 g、MgSO4 ·7H2O 0.50 g、NaNO3 2.50 g、CaCl2·2H2O 0.10 g、FeCl3 0.02 g、吐溫-80 1.20 mL溶于1 000 mL去離子水中組成的培養(yǎng)基在添加微量元素復(fù)合液（50 mg/mL CuCl2·2H2O+20 mg/mL MnSO4·H2O+10 mg/mL ZnSO4·7H2O）3 mL、洋蔥100 g、麥麩10 g后，并且培養(yǎng)基起始pH 4.5、培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、培養(yǎng)時(shí)間7 d，則搖瓶發(fā)酵的漆酶產(chǎn)酶量最高可達(dá)1 121 U/mL，顯示出了良好的工業(yè)開發(fā)潛力。

關(guān)鍵詞：漆酶；裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）；篩選；產(chǎn)酶培養(yǎng)基；優(yōu)化

中圖分類號：Q554+.9；S646.1+9；Q93-33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：0439-8114（2013）12-2792-06

Isolation of Schizophyllum commune Producing Laccase and Optimization of Laccase Production Conditions

ZHAO Wen-juan，XU Sheng-yun，REN Ping

（Enzyme Engineering Institute of Shaanxi Sciences / Shaanxi Engineering Center for Enzyme Technology， Xi’an 710600， China）

Abstract： A Schizophyllum commune Fr. strain mys005 producing laccase was isolated from the rotten wood lawn in forest of Qinlin. The culture method for laccase production， medium composition and cultivation conditions was optimized. Results showed that the suitable cultivation method for S. commune strain mys005 to produce laccase was shallow liquid shaking culture. Trace elements compound liquid containing Cu2+， Mn2+， Zn2+， onion （Allium cepa L.）， wheat （Triticum aestivum L.） bran could promote laccase production； while guaiacol could inhibit the growth and laccase production. If adding trace element compound solution（50 mg/mL CuCl2·2H2O+20 mg/mL MnSO4·H2O+ 10 mg/mL ZnSO4·7H2O） 3 mL， onion 100 g， wheat bran 10 g，in the medium containing fresh potato （Solanum tuberosum L.） 200 g， K2HPO4 1.00 g， NaCl 0.50 g， MgSO4·7H2O 0.50 g， NaNO3 2.50 g， CaCl2·2H2O 0.10 g、FeCl3 0.02 g、tween-80 1.20 mL in 1 000 mL deionized water， and keeping the starting pH at 4.5， starting temperature at 30 ℃， culture shaker speed at 200 r/min， culturing for 7 d， the laccase enzyme production yield in shake flask fermentation could be up to a maximum of 1 121 U/mL， showing great potential for industrial development.

Key words： laccase； Schizophyllum commune Fr.； isolation； enzyme producing medium； optimization

漆酶（Laccase，EC1.10.3.2）是一種含銅元素的多酚氧化酶，是重要的木質(zhì)纖維（Ligno cellulose）降解酶之一[1]。20世紀(jì)末，以擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）的白腐菌（White rot fungi）為代表的真菌產(chǎn)生的漆酶成為了國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，真菌分泌的漆酶主要具有催化木質(zhì)素的降解、去除有毒化合物的毒性、促進(jìn)真菌色素的合成等作用?；诖?，真菌漆酶在造紙工業(yè)中的生物制漿和紙漿生物漂白、有毒造紙廢水處理、酶法脫墨等方面表現(xiàn)出了相當(dāng)?shù)难芯績r(jià)值和應(yīng)用潛力[2-8]。

裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）又稱白參、樹花，隸屬于真菌門（Eumycota）擔(dān)子菌亞門層菌綱（Hymenomycetes）傘菌目（Agaricales）裂褶菌科（Schizophyllaceae）裂褶菌屬（Schizophyllum sp.），是一種珍貴的食、藥兩用真菌[9]。關(guān)于裂褶菌產(chǎn)漆酶的文獻(xiàn)較少，李夢杰等[10]報(bào)道了一株產(chǎn)漆酶能力強(qiáng)且產(chǎn)酶速度快的裂褶菌菌株GGHN08-104，其在固體發(fā)酵培養(yǎng)基里產(chǎn)漆酶活力達(dá)2 449.02 U/g；Muhammad等[11]利用裂褶茵對紡織品染料進(jìn)行脫色研究，發(fā)現(xiàn)裂褶菌菌株IBL-06的產(chǎn)漆酶活力達(dá)到了179 U/mL；黃彩霞等[12]報(bào)道了裂褶菌用于廢新聞紙的脫墨研究試驗(yàn)，結(jié)果裂褶菌能分泌高活力的漆酶，并能對廢新聞紙進(jìn)行高效脫墨。已有試驗(yàn)[13，14]證明，對裂褶菌產(chǎn)漆酶情況及在造紙行業(yè)的開發(fā)應(yīng)用進(jìn)行深入研究很有必要。為了得到造紙工業(yè)用高活力漆酶，試驗(yàn)從自然界篩選到一株產(chǎn)漆酶的裂褶菌菌株，并對其產(chǎn)酶培養(yǎng)方式、液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化比較，為其在造紙工業(yè)和環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種采樣

采樣地點(diǎn)在秦嶺驪山；主要采集腐木樹皮上的白色菌苔、腐木屑及腐木根基處的腐殖土[15]。

1.2 試劑與儀器

培養(yǎng)基所用新鮮馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）、洋蔥（Allium cepa L.）和當(dāng)年麥（Triticum aestivum L.）麩均為市售，試劑均為分析純或生化級試劑；測定漆酶活力的2， 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）銨鹽[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]為美國Sigma公司產(chǎn)品。儀器主要有DU640型紫外/可見光分光光度計(jì)（美國貝克曼公司）、KYC-1102型恒溫培養(yǎng)搖床（上海新苗醫(yī)療器械有限公司）、PYS-DHS型恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 真菌斜面保藏培養(yǎng)基（PDA綜合培養(yǎng)基） 由新鮮馬鈴薯（切碎）200 g、葡萄糖 20.0 g、KH2PO4 3.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、維生素 B1 8 mg、瓊脂 20.0 g溶于1 000 mL去離子水中組成，調(diào)培養(yǎng)基pH為6.0[16]。

1.3.2 真菌初篩（純化）培養(yǎng)基 ①愈創(chuàng)木酚PDA（G-PDA）培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基滅菌后添加經(jīng)無菌過濾器除菌的4 μL/mL的愈創(chuàng)木酚-乙醇溶液[4]，使培養(yǎng)基中愈創(chuàng)木酚的終濃度為0.4 μL /mL；② α-萘酚PDA（αN- PDA）培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基滅菌后添加經(jīng)無菌過濾器除菌的50 mmol/L的α-萘酚-乙醇溶液，使培養(yǎng)基中α-萘酚的終濃度為5 mmoL/L。

1.3.3 復(fù)篩產(chǎn)酶搖瓶培養(yǎng)基（基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基） 配方①，在綜合PDA培養(yǎng)基組分中去掉瓊脂成分；配方②，由新鮮馬鈴薯（切碎）200 g、K2HPO4 1.00 g、NaCl 0.50 g、MgSO4 ·7H2O 0.50 g、NaNO3 2.50 g、CaCl2 ·2H2O 0.10 g、 FeCl3 0.02 g、吐溫-80 1.20 mL溶于1 000 mL去離子水中組成，調(diào)培養(yǎng)基pH為6.0。

1.3.4發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基 配方③，由配方②1 000 mL+微量元素復(fù)合液（50 mg/mL CuCl2·2H2O+20 mg/mL MnSO4·H2O+10 mg/mL ZnSO4·7H2O）3 mL組成；配方④，由配方③+新鮮洋蔥（切碎）100 g/L組成；配方⑤，由配方③+新鮮洋蔥（切碎）100 g/L+當(dāng)年麥麩10 g/L組成

1.4 方法

1.4.1 產(chǎn)漆酶菌株初篩 ①稱取1～5 g所采菌樣（較大的腐木屑與菌苔剪碎），裝入有玻璃珠與50 mL 去離子水的250 mL三角瓶中，在搖床上浸泡振蕩30 min以上，制成菌懸液。取0.2 mL菌懸液分別涂布在G-PDA培養(yǎng)基、αN-PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行初篩，每個(gè)菌樣分別涂5～8個(gè)平板，置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)，每天觀察菌落生長及變色圈產(chǎn)生情況。②將在G-PDA培養(yǎng)基上初篩后產(chǎn)生棕紅色、淺紅黃色變色圈的菌株以及在αN-PDA培養(yǎng)基上初篩后產(chǎn)生淺藍(lán)紫色變色圈的菌株挑出，繼續(xù)在相對應(yīng)的G-PDA培養(yǎng)基、αN-PDA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線接種，置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)，每天觀察菌落生長及變色圈的產(chǎn)生情況。如此反復(fù)直到分離到產(chǎn)生變色圈的單菌落，記錄變色圈的顏色與深淺，測量菌絲圈直徑（d1）及變色圈的直徑（d2），由d2/d1比值大小初步判斷菌株產(chǎn)漆酶的能力。將初篩到的產(chǎn)漆酶菌株接入斜面保藏培養(yǎng)基中，以供復(fù)篩[17]。

1.4.2 產(chǎn)漆酶菌株復(fù)篩 初篩得到的斜面菌種用PDA綜合培養(yǎng)基平板活化，打成直徑8 mm的菌餅，取不同數(shù)量的菌餅分別接種于配方①、配方②中，250 mL搖瓶裝液50 mL，30℃、150 r/min培養(yǎng)7 d，發(fā)酵液過濾，得粗酶液用于測定漆酶活性。產(chǎn)酶活性高者即為復(fù)篩得到的目的菌株，用于下一步研究。

1.4.3 確定產(chǎn)漆酶培養(yǎng)方式 用配方①和配方②，分別選擇靜置與振蕩、淺層（50 mL）與深層（100、150 mL）2組對比培養(yǎng)方式進(jìn)行復(fù)篩菌株產(chǎn)漆酶發(fā)酵試驗(yàn)，測定發(fā)酵濾液的酶活，以確定合適的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方式，每處理重復(fù)3次。

1.4.4 產(chǎn)漆酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 向試驗(yàn)確定的基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基（配方②）中分別添加不同量的微量元素復(fù)合液以及洋蔥、麩皮、愈創(chuàng)木酚進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定發(fā)酵濾液的酶活，對產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基進(jìn)行初步優(yōu)化，每處理重復(fù)3次。

1.4.5 產(chǎn)酶培養(yǎng)條件確定 培養(yǎng)基選用配方⑤，分別比較不同起始pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、培養(yǎng)時(shí)間（4、5、6、7、8 d）、培養(yǎng)溫度（25、28、30、35 ℃）、接種量（直徑8 mm的菌餅2、3、4、5片）、培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速（120、150、180、200 r/min）對產(chǎn)漆酶菌株漆酶產(chǎn)量的影響。500 mL三角瓶裝液100 mL，培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速及起始pH和培養(yǎng)時(shí)間用優(yōu)化后的數(shù)值，5個(gè)培養(yǎng)條件的處理都重復(fù)3次[18]。

1.4.6 漆酶活性測定方法（ABTS法） 酶液（發(fā)酵濾液）、緩沖液和底物ABTS都先在30 ℃下預(yù)熱；在3 mL反應(yīng)體系中，先加入酶液0.1 mL，然后分別加入 pH 4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液2.5 mL、1 mmol/L的 ABTS 0.4 mL，溫度30 ℃啟動(dòng)反應(yīng)，每15 s在紫外/可見光分光光度計(jì)上測定一個(gè)反應(yīng)體系在420 nm下的OD值，求得反應(yīng)前3 min內(nèi)反應(yīng)體系的OD值變化用于計(jì)算酶活。要求酶反應(yīng)體系的OD值變化在前3 min內(nèi)呈線性關(guān)系，否則需將酶液用緩沖液稀釋到合適倍數(shù)。以每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol/L ABTS（或生成1 μmol /L ABTS自由基）的酶量為一個(gè)酶活單位[19，20]。計(jì)算公式：

漆酶活性=106/ε·b×△OD/△t，

比酶活=漆酶活性/V。

式中，酶活的單位為μmol/（L·min），比酶活單位為U/mL；ε為ABTS自由基的摩爾吸光系數(shù)，ε420=3.6×104 L/（mol·cm）；b為比色管厚度（cm）；V是反應(yīng)體系中加入酶液的體積（mL）；△OD為在反應(yīng)時(shí)間（△t）內(nèi)的吸光度增加值；△t是反應(yīng)時(shí)間（min）。試驗(yàn)中漆酶產(chǎn)量以比酶活表示。

1.4.7 產(chǎn)漆酶菌株的分子鑒定 將復(fù)篩得到的產(chǎn)漆酶活力高的菌株用PDA綜合培養(yǎng)基平板純化至少3次以上，進(jìn)而得到純度高的單菌落，將該菌落送樣至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行真菌ITS分子鑒定。基因組DNA提取采用生工SK1375真菌基因組DNA抽提試劑盒，引物序列分別有ITS1： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，20 bp；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，19 bp。DNA測序用PCR純化產(chǎn)物27f和1 492 r實(shí)施完成；利用GenBank中的BLAST軟件搜索同源序列進(jìn)行比對，對該菌株進(jìn)行分子鑒定[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)漆酶菌株初篩結(jié)果

將野外采集到的菌樣經(jīng)過適當(dāng)稀釋后，在G-PDA和αN-PDA 2種初篩培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，3 d后在G-PDA平板上長出了深棕紅色變色圈的菌落，將其在G-PDA和αN-PDA平板上反復(fù)劃線純化分離，最終在G-PDA平板上得到了產(chǎn)生明顯深棕紅色變色圈的單菌落，而在αN- PDA平板上這些菌株并不產(chǎn)生任何顏色的變色圈；將在G-PDA平板上得到的菌株命名為mys005，其菌落形態(tài)為蓬松白色綿毛狀，中央形成同心圓狀的環(huán)紋區(qū)，菌絲濃密厚重，堆積高出培養(yǎng)基表面，不向培養(yǎng)基內(nèi)部生長，培養(yǎng)基背面始終為白色；變色圈顏色為深棕紅色，培養(yǎng)5 d的變色圈直徑（d2）為18 mm，培養(yǎng)5 d的菌絲圈直徑（d1）為11 mm，d2/d1比值為1.6。菌株mys005在G-PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征與萬力等[22]報(bào)道的結(jié)果基本一致，說明菌株mys005為裂褶菌的可能性比較大。

2.2 培養(yǎng)方式與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

綜合PDA培養(yǎng)基（復(fù)篩配方①）適合所有真菌生長，而配方②是在配方①的基礎(chǔ)上添加了一些常用的無機(jī)鹽成分，添加吐溫-80是為了利于酶的滲出，從而減少細(xì)胞內(nèi)酶合成的抑制作用。王佳玲等[23]報(bào)道稱，國內(nèi)外學(xué)者在進(jìn)行白腐菌漆酶的液體培養(yǎng)時(shí)，采用靜置培養(yǎng)方式的次數(shù)比振蕩培養(yǎng)方式的多，采用深層培養(yǎng)方式的次數(shù)比淺層培養(yǎng)方式的多，且前者比后者更有利于提高漆酶產(chǎn)量。因此試驗(yàn)分別對靜置與振蕩、淺層與深層培養(yǎng)方式進(jìn)行了比較試驗(yàn)，振蕩培養(yǎng)方式的條件是培養(yǎng)溫度30 ℃，直徑8 mm的菌餅在裝液量為50 mL時(shí)接種1片、在100 mL時(shí)接種2片、在150 mL時(shí)接種3片，150 r/min培養(yǎng)7 d；靜置培養(yǎng)方式的培養(yǎng)溫度與接種量均與振蕩培養(yǎng)方式條件一致，但培養(yǎng)過程中每隔2 d搖動(dòng)三角瓶一次，結(jié)果見表1。從表1中可以看出，菌株mys005的液體發(fā)酵采用振蕩培養(yǎng)方式的產(chǎn)漆酶量高于靜置培養(yǎng)方式、淺層培養(yǎng)方式的產(chǎn)漆酶量高于深層培養(yǎng)方式，這說明菌株mys005的生長需要消耗大量的氧氣，這一結(jié)果與李夢杰等[10]的研究結(jié)果相一致。另外，在采用振蕩培養(yǎng)時(shí)，配方②比配方①的漆酶產(chǎn)量高，因此初步確定菌株mys005的培養(yǎng)以新鮮馬鈴薯（切碎）200 g、K2HPO4 1.00 g、NaCl 0.50 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、NaNO3 2.50 g、CaCl2·2H2O 0.10 g、 FeCl3 0.02 g、吐溫-80 1.20 mL溶于1 000 mL去離子水中組成的配方②（調(diào)培養(yǎng)基pH為6.0）為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，采用淺層振蕩培養(yǎng)方式（250 mL三角瓶裝液量50 mL）。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1 微量元素對菌株mys005產(chǎn)漆酶的影響 前人研究指出，微量元素鐵、鋅、錳、鈷、銅等往往是酶的活性基組成部分[23，24]，是酶的激活劑，對酶活的影響不容忽視。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，銅對漆酶有活化作用；另外對于某些白腐菌而言，在Mn2+和Cu2+存在的前提下能顯著提高漆酶的酶活。因此試驗(yàn)以配方②為基礎(chǔ)，通過往培養(yǎng)基中添加不同量的微量元素復(fù)合液（50 mg/mL CuCl2·2H2O+20 mg/mL MnSO4·H2O+10 mg/mL ZnSO4·7H2O），比較了菌株mys005搖瓶發(fā)酵（250 mL三角瓶裝液50 mL，直徑8mm的菌餅1片，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)7 d）的產(chǎn)漆酶情況。結(jié)果見表2。由表2可見，添加微量元素Cu2+、Mn2+、Zn2+能促進(jìn)菌株mys005提高漆酶產(chǎn)量，隨著微量元素復(fù)合液添加量的增加，產(chǎn)漆酶量也相應(yīng)提高，當(dāng)添加微量元素復(fù)合液3 mL時(shí)，產(chǎn)漆酶量比對照提高了298.39%，達(dá)到了247 U/mL。

2.3.2 洋蔥對菌株mys005產(chǎn)漆酶的影響 王佳玲等[23]報(bào)道稱，在合成培養(yǎng)基中添加洋蔥可以提高漆酶的產(chǎn)量；趙琪等[25]報(bào)道，木腐菌具有較強(qiáng)的分解木質(zhì)素、纖維素的能力，其生長發(fā)育需要鉀、鎂、鈣、磷等礦質(zhì)營養(yǎng)元素的參與。洋蔥每百克鮮品含鈣40 mg、磷50 mg、鐵1.8 mg、維生素C 8 mg，還含有胡蘿卜素、維生素B1和尼克酸、前列腺素A、二烯丙基二硫化物及硫氨基酸等成分，營養(yǎng)非常全面，而且洋蔥是一種價(jià)廉易得的蔬菜，若能提高漆酶產(chǎn)量，將對工業(yè)化生產(chǎn)漆酶降低成本、提高經(jīng)濟(jì)效益產(chǎn)生重大的影響。因此試驗(yàn)以配方③為基礎(chǔ)，通過往培養(yǎng)基中添加不同量的洋蔥（切碎），比較了菌株mys005搖瓶發(fā)酵（250 mL三角瓶裝液50 mL，直徑8mm的菌餅1片，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)7 d）的產(chǎn)漆酶情況。結(jié)果見表3。從表3中可以看出，洋蔥的加入確實(shí)能提高菌株mys005產(chǎn)漆酶的能力，其中以添加量為100 g/L的產(chǎn)酶量達(dá)到最高，其搖瓶發(fā)酵液的比酶活比對照提高了260.61%，達(dá)到了238 U/mL，隨后雖添加量增大而漆酶比酶活卻基本保持平穩(wěn)。因此確定洋蔥的適宜添加量為100 g/L。

2.3.3 愈創(chuàng)木酚對菌株mys005產(chǎn)漆酶的影響 研究漆酶相關(guān)文獻(xiàn)[23]指出，結(jié)構(gòu)與木質(zhì)素有關(guān)的低分子芳香化合物或木質(zhì)素降解的碎片化合物可以作為漆酶的誘導(dǎo)劑來提高酶活，而愈創(chuàng)木酚是具有木質(zhì)素特征苯環(huán)結(jié)構(gòu)的木質(zhì)素類似物，對某些白腐菌漆酶的產(chǎn)生有一定的誘導(dǎo)促進(jìn)作用，侯紅漫等[26]在研究糙皮側(cè)耳[Pleurotus ostreatus（Jacq.ex Fr.）Quel.]的漆酶產(chǎn)量時(shí)發(fā)現(xiàn)添加0.5 mmol/L的愈創(chuàng)木酚可使糙皮側(cè)耳培養(yǎng)液的產(chǎn)酶量提高2.5倍。但是愈創(chuàng)木酚具有毒性，濃度高時(shí)會(huì)對菌體的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用，因此愈創(chuàng)木酚的添加量和添加時(shí)間對漆酶產(chǎn)量的提升與否將是很關(guān)鍵的因素。試驗(yàn)以配方③為基礎(chǔ)，培養(yǎng)條件為500 mL三角瓶裝液100 mL，直徑8mm的菌餅2片，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)7 d，通過用濃度4 μL/mL愈創(chuàng)木酚-乙醇溶液的添加量（添加量分別是1.0、1.5、2.0 mL）和添加時(shí)間（試驗(yàn)開始時(shí)添加、試驗(yàn)第三天添加）分別進(jìn)行試驗(yàn)，比較了菌株mys005搖瓶發(fā)酵的產(chǎn)漆酶情況。結(jié)果見表4。由表4可見，當(dāng)試驗(yàn)開始添加了1.0 mL愈創(chuàng)木酚-乙醇溶液后，菌株mys005漆酶的比酶活降低了72.48%，添加了2.0 mL的愈創(chuàng)木酚-乙醇溶液后漆酶比酶活降低了86.43%；當(dāng)試驗(yàn)第三天添加了1.0 mL的愈創(chuàng)木酚-乙醇溶液后，菌株mys005漆酶的比酶活降低了63.18%，添加了2.0 mL后的漆酶比酶活降低了85.27%。由此看來愈創(chuàng)木酚并不是菌株mys005的誘導(dǎo)劑，反而是抑制劑；而添加時(shí)間的早晚并不影響愈創(chuàng)木酚添加量對菌株mys005產(chǎn)漆酶的抑制作用。

2.3.4 麥麩對菌株mys005產(chǎn)漆酶的影響 在產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基中添加含有木質(zhì)素的天然植物原料如稻草、鋸木屑等可選擇性地提高木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)量[23]。王宜磊[27]研究了彩絨革蓋菌[Coriolus versicolor（L. ex Fr.）Quél.]產(chǎn)漆酶的能力，并對產(chǎn)酶條件和酶活性進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以麥麩替代葡萄糖后，漆酶產(chǎn)量由131 U/mL提高到了622 U/mL。研究表明，小麥麩皮主要由纖維素（24%）、半纖維素（62%）、木質(zhì)素（11%）等組成[28]。初步判斷麥麩中的木質(zhì)素、半纖維素有可能對漆酶產(chǎn)量有促進(jìn)作用。另外麥麩在中國北方是產(chǎn)量大、價(jià)格廉的農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物，若能作為漆酶工業(yè)生產(chǎn)的原料則經(jīng)濟(jì)價(jià)值提升的空間就非常大。試驗(yàn)以配方④為基礎(chǔ)，通過不同添加量的麥麩，比較了菌株mys005搖瓶發(fā)酵（500 mL三角瓶裝液100 mL，直徑8 mm的菌餅2片，30 ℃、170 r/min培養(yǎng)7 d）的產(chǎn)漆酶情況，結(jié)果見表5。由表5可見，培養(yǎng)基中添加麥麩對菌株mys005產(chǎn)漆酶有較大的促進(jìn)作用，隨著添加量的增加，產(chǎn)酶量大大提高，當(dāng)麥麩添加量為15 g/L時(shí)，產(chǎn)漆酶量比對照提高了150.87%，達(dá)到了868 U/mL；由產(chǎn)酶量結(jié)合成本因素，最終確定麥麩的添加量以10 g/L為宜。但是究竟是麥麩中的哪種成份在起作用，還需要進(jìn)一步試驗(yàn)確認(rèn)。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1 培養(yǎng)基不同起始pH，不同培養(yǎng)時(shí)間對菌株mys005產(chǎn)漆酶的影響 趙琪等[25]報(bào)道，裂褶菌的菌絲生長最適pH為5～6、子實(shí)體生長最適pH為4～5，因此試驗(yàn)選擇培養(yǎng)基的起始pH分別調(diào)整為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，搖瓶培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)置為4、5、6、7、8 d，以此測定菌株mys005發(fā)酵液的酶活，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，當(dāng)培養(yǎng)基起始pH為4.5～5.5時(shí)，適于菌株mys005產(chǎn)漆酶，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，產(chǎn)漆酶量不斷提高，基本上在第七天、第八天達(dá)到最高值；其中當(dāng)pH為4.5、培養(yǎng)時(shí)間到7 d時(shí)產(chǎn)漆酶量最高，達(dá)到了986 U/mL；而當(dāng)pH<4.5和pH>6.5時(shí)，產(chǎn)漆酶量都大大降低。因此確定菌株mys005培養(yǎng)基的起始pH為4.5～5.0，培養(yǎng)時(shí)間為7 d。

2.4.2 不同接種量、培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度對菌株mys005產(chǎn)漆酶的影響 培養(yǎng)基起始pH 4.5、500 mL三角瓶裝液量100 mL，接種量分別是直徑8 mm的菌餅2、3、4、5片；培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速分別是120、150、180、200 r/min；培養(yǎng)溫度分別是25、28、30、35 ℃，培養(yǎng)7 d，測定菌株mys005的產(chǎn)漆酶情況，結(jié)果分別見表6、表7、表8。從表6、表7、表8綜合分析可知，培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速對菌株mys005液體發(fā)酵的產(chǎn)漆酶量影響較大，接種量次之，培養(yǎng)溫度的影響最小。因此菌株mys005液體發(fā)酵的適宜培養(yǎng)溫度為28～30 ℃、接種量為直徑8mm的菌餅2～3片、培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速180～200 r/min。

2.2 分子鑒定結(jié)果

對菌株mys005高純度的單菌落進(jìn)行真菌ITS分子鑒定，基于rDNA ITS區(qū)段進(jìn)行克隆測序，并對ITS序列進(jìn)行核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank同源性檢索比對，將從GenBank檢索獲得的相關(guān)分類元真菌的ITS序列連同菌株mys005 ITS序列一起用于系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，受試菌株mys005與GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中Schizophyllum commune Fr.具有100%的同源性，屬于裂褶菌屬的裂褶菌。

3 小結(jié)

裂褶菌菌株mys005的生長需要消耗大量的氧氣，其液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶應(yīng)選擇淺層振蕩培養(yǎng)方式為宜。微量元素、洋蔥、麥麩的添加都能大幅度提高裂褶菌菌株mys005的漆酶產(chǎn)量；在新鮮馬鈴薯（切碎）200 g、K2HPO4 1.00 g、NaCl 0.50 g、MgSO4 ·7H2O 0.50 g、NaNO3 2.50 g、CaCl2 ·2H2O 0.10 g、 FeCl3 0.02 g、吐溫-80 1.20 mL溶于1 000 mL去離子水中組成的培養(yǎng)基里添加微量元素復(fù)合液（50 mg/mL CuCl2·2H2O+20 mg/mL MnSO4·H2O+10 mg/mL ZnSO4·7H2O）3 mL、新鮮洋蔥100 g（切碎）、麥麩10 g后，于500 mL三角瓶裝液100 mL，在接種后調(diào)起始pH 4.5、培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、培養(yǎng)7 d，則搖瓶發(fā)酵的漆酶產(chǎn)酶量最高可達(dá)1 121 U/mL，顯示出了良好的工業(yè)開發(fā)潛力。

愈創(chuàng)木酚對裂褶菌菌株mys005產(chǎn)漆酶具有抑制作用，添加時(shí)間的早晚不改變其抑制效果，當(dāng)濃度4 μL/mL的愈創(chuàng)木酚-乙醇溶液用量為1.0 mL時(shí)，產(chǎn)漆酶量可下降60%以上。

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