摘要：為了更好地利用黃花烏頭（Aconitum coreanum）資源，提高其產(chǎn)品附加值，以黃花烏頭中鹽酸關(guān)附甲素的提取量為指標(biāo)， 通過設(shè)立正交試驗(yàn)確定影響提取率的主要因素以及最佳提取條件。結(jié)果表明，最佳的熱回流法提取工藝條件為： 提取溶劑為50%乙醇，提取溫度為80 ℃，料液比為1∶20，提取時(shí)間為40min。此提取工藝簡(jiǎn)單可行、穩(wěn)定可靠，適用于鹽酸關(guān)附甲素的大規(guī)模提取。

關(guān)鍵詞：黃花烏頭（Aconitum coreanum）；鹽酸關(guān)附甲素； 提取工藝； 高效液相色譜法； 熱回流法； 正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：Q949.746.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）18-4479-02

黃花烏頭（Aconitum coreanum）[1]，又名關(guān)白附、白附子、竹節(jié)白附、黃烏拉花[2]，為毛茛科烏頭屬植物，為中醫(yī)臨床常用中藥之一。從20世紀(jì)末到21世紀(jì)初，各國(guó)的科學(xué)工作者一直致力于黃花烏頭中活性成分的提取、分離、純化的研究[3]。根據(jù)文獻(xiàn)我們可以了解到，很多現(xiàn)代化的研究方法被應(yīng)用到了黃花烏頭鹽酸關(guān)附甲素的提取中，這些方法的研究讓很多人眼前一亮，看到了成分提取行業(yè)發(fā)展的新方向。同時(shí)，這也讓越來越多的人關(guān)注并且加入到這方面的研究中來[4-6]。隨著研究的不斷深入，也暴露出一些原本就存在的問題，例如對(duì)外界環(huán)境的污染、成本投入過高等實(shí)際問題。由于方法本身的問題、局限性以及現(xiàn)階段科學(xué)技術(shù)水平的限制，使得這些方法在短時(shí)間內(nèi)無法應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，不能轉(zhuǎn)化為經(jīng)濟(jì)效益。而傳統(tǒng)意義上的提取方法似乎并未受到人們的關(guān)注，很少有這方面的研究成果報(bào)道。加熱回流提取法相對(duì)于其他的提取方法具有成本低、污染小、可控性強(qiáng)、提取率穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，又是生產(chǎn)中常采用的方法。本試驗(yàn)采用了傳統(tǒng)的加熱回流提取法對(duì)黃花烏頭中鹽酸關(guān)附甲素的提取條件進(jìn)行研究，采用藥典中規(guī)定的高效液相色譜法[7]對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定，而不是采取以往的分光光度法，并通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)尋找影響提取率的主要因素和最佳條件，希望能夠?yàn)閷?shí)際生產(chǎn)提供一些理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

黃花烏頭干根，2011年9月采于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院藥用植物園。

1.2 試驗(yàn)儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀、SPD-20A型紫外檢測(cè)器（島津公司）；HH-S4型恒溫水浴鍋（購(gòu)于金壇市醫(yī)療儀器廠）；LG-08A型裝高速中藥粉碎機(jī)（400g）（購(gòu)于深圳市百源堂醫(yī)療器械有限公司）；XL-204型電子天平（梅特勒-托利多）。

1.3 藥品與試劑

鹽酸關(guān)附甲素對(duì)照品，購(gòu)于江西本草天工科技有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純。

1.4 鹽酸關(guān)附甲素的提取

將新鮮的黃花烏頭用清水洗凈，陰干，粉碎，過60目篩，備用。精確稱取10.0 g黃花烏頭粉末，用20 mL氨水潤(rùn)濕30 min，然后將粉末倒入磨口錐形瓶中，加入乙醇，置于水浴中回流提取。提取完成后將錐形瓶取出，放置冷卻至室溫，然后過濾，得到濾液。濾液抽濾，減壓濃縮，再加入HCl酸化，過濾，濾液加50 mL石油醚脫脂，加氨水堿化，調(diào)節(jié)pH至9～10，加入100 mL氯仿，萃取，取氯仿層至25 mL容量瓶中，干燥，用甲醇定容至刻度，搖勻，備用。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)了4因素3水平正交試驗(yàn)，考察了提取溫度（A）、料液比（B）、乙醇濃度（C）以及提取時(shí)間（D）對(duì)黃花烏頭中鹽酸關(guān)附甲素提取的影響作用并得出最佳工藝條件。

1.6 鹽酸關(guān)附甲素的測(cè)定方法

采用高效液相色譜法測(cè)定鹽酸關(guān)附甲素含量，色譜條件為：色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為1%甲酸-乙腈溶液，流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm；柱溫30 ℃；檢測(cè)時(shí)間25 min；進(jìn)樣量20 μL。

鹽酸關(guān)附甲素提取率=鹽酸關(guān)附甲素濃度×25/藥粉干重×1 000‰

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)照品溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取鹽酸關(guān)附甲素對(duì)照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成含鹽酸關(guān)附甲素1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2.5、5.0、10.0 mL分別置于3個(gè)10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。配制成鹽酸關(guān)附甲素濃度分別為250、500、1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

用高效液相色譜儀對(duì)3個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。然后以鹽酸關(guān)附甲素標(biāo)準(zhǔn)濃度為縱坐標(biāo)，以峰面積為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到線性回歸方程。鹽酸關(guān)附甲素進(jìn)樣量在250～1 000 μg/mL范圍內(nèi)有較好的線性，方程為y=2 177.509x+1 673 485，r=0.989 2。

2.2 精密度試驗(yàn)

用配置好的鹽酸關(guān)附甲素標(biāo)準(zhǔn)樣品，重復(fù)測(cè)試5次，并計(jì)算其峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果經(jīng)過測(cè)定，鹽酸關(guān)附甲素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.24%，表明高效液相色譜儀精密度良好，可以進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)的測(cè)定。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次黃花烏頭用相同條件提取5份，對(duì)其鹽酸關(guān)附甲素含量進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算其峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果提取5份黃花烏頭鹽酸關(guān)附甲素，其峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.28%，表明試驗(yàn)具有很好的重復(fù)性。

2.4 數(shù)據(jù)分析

由表2可知，各個(gè)因素對(duì)黃花烏頭中鹽酸關(guān)附甲素提取的影響順序?yàn)锳>B>D>C，即，提取溫度>料液比> 提取時(shí)間>乙醇濃度。最佳搭配為A2B2D2C1，最優(yōu)的提取條件為A2B2C1D2，即，提取溫度為80 ℃、料液比為1∶20、乙醇濃度50%、提取時(shí)間40 min。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)的熱回流提取法并利用高效液相色譜法對(duì)黃花烏頭中鹽酸關(guān)附甲素提取工藝進(jìn)行了研究，得出結(jié)論：提取溫度為80 ℃、料液比為1∶20、乙醇濃度50%、提取時(shí)間40 min為黃花烏頭中鹽酸關(guān)附甲素?zé)峄亓魈崛〉淖罴褩l件，其中提取溫度對(duì)提取率的影響最大，其次是料液比和提取時(shí)間，乙醇濃度的影響作用最小。

本試驗(yàn)采用了傳統(tǒng)的熱回流提取法，與其他提取工藝相比，此方法簡(jiǎn)單易行、污染小、成本低，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，相對(duì)于以往的分光光度法更靈敏、準(zhǔn)確。相關(guān)文獻(xiàn)大都采用分光光度法測(cè)定鹽酸關(guān)附甲素含量，此種方法雖然可行但誤差很大。采用高效液相色譜法測(cè)定鹽酸關(guān)附甲素的含量，準(zhǔn)確度大大提高，結(jié)果更可信。

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