摘要：在實(shí)驗(yàn)室對(duì)從五峰馬里蘭煙空莖病病株分離的病原菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、致病性鑒定和部分生物學(xué)特性研究。結(jié)果表明，分離物在LB培養(yǎng)基上的菌落淡黃色，圓形或不定形，表面光滑，微凸起，半透明，邊緣整齊。在電鏡下觀察，菌體短桿狀，大小（0.5～1.0） μm×（2.2～3.0）μm，周生鞭毛2～8根，無莢膜，不產(chǎn)生芽孢，革蘭氏染色陰性。在結(jié)晶紫果膠酸鹽（CVP）培養(yǎng)基上產(chǎn)生杯狀凹陷。病菌能在5%鹽濃度下生長(zhǎng)，能在37 ℃下生長(zhǎng)，能利用蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸，兼性厭氧，能利用檸檬酸鹽，但不能產(chǎn)生吲哚。結(jié)合該菌形態(tài)學(xué)特征、致病性和部分生物學(xué)特性，初步確定引起五峰馬里蘭煙空莖病的病原為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora）。

關(guān)鍵詞：五峰馬里蘭煙；煙草；空莖??；病原鑒定；胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種

中圖分類號(hào)：S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）18-4388-02

五峰馬里蘭煙是湖北省宜昌市煙草公司1981年從美國(guó)引進(jìn)的低焦油含量煙草品種，現(xiàn)定名為五峰1號(hào)[1]，作為優(yōu)質(zhì)煙葉品種在五峰縣推廣。煙草空莖病因感染后莖干中空腐爛而得名[2]。伴隨著五峰縣馬里蘭煙種植面積的擴(kuò)大，空莖病成為制約五峰縣煙葉發(fā)展的一種主要病害[3]，為此，于2011年開始對(duì)其危害情況進(jìn)行調(diào)查，開展病原菌鑒定、生物學(xué)特性研究。

1 材料和方法

1.1 供試材料

分離病株分別采自于湖北省五峰縣付家堰鄉(xiāng)火山村、大龍坪村煙田，選取具有典型癥狀的煙葉和莖干。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離純化 切取新鮮病葉、病莖病健交界處組織， 經(jīng)75%乙醇和0.1%氯化汞溶液表面消毒， 無菌水沖洗后加無菌水研磨制成懸浮液， 采用平板劃線法分離[4]。分離培養(yǎng)采用結(jié)晶紫果膠酸鹽（CVP）培養(yǎng)基[5]。將劃線后的培養(yǎng)皿置于28 ℃培養(yǎng)箱， 2 d后出現(xiàn)杯狀凹陷菌落。5 d后選取單個(gè)菌落在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)[4]。

1.2.2 致病性測(cè)定 將分離純化的病原菌在LB培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)2～3 d，加5～10 mL無菌生理鹽水制成菌懸液。滅菌土中栽培煙葉的幼苗長(zhǎng)到5～6片葉時(shí)采用注射接種法進(jìn)行接種，用注射器緩慢地把 1 mL液體LB 培養(yǎng)基菌懸液注入到傷口表面， 形成懸浮滴，以生理鹽水作為空白對(duì)照（CK）。培養(yǎng)環(huán)境溫度為28 ℃、相對(duì)濕度為90%，觀察發(fā)病情況。

1.2.3 病原菌的形態(tài)鑒定 病原菌在28 ℃培養(yǎng)18～24 h，進(jìn)行革蘭氏染色，鞭毛染色采用西薩基爾鞭毛染色法[4]，置光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下觀察。

1.2.4 病原菌的生理生化測(cè)定 對(duì)病菌進(jìn)行耐鹽性、碳水化合物利用、檸檬酸鹽利用，吲哚試驗(yàn)和37 ℃下生長(zhǎng)試驗(yàn)等測(cè)試，方法參照文獻(xiàn)[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)

分離物在LB培養(yǎng)基上的菌落淡黃色， 圓形或不定形，表面光滑，微凸起，半透明，邊緣整齊。在電鏡下進(jìn)行觀察（圖1），菌體短桿狀，大?。?.5～1.0）μm×（2.2～3.0） μm，周生鞭毛2～8根，無莢膜，不產(chǎn)生芽孢，革蘭氏染色陰性。在結(jié)晶紫果膠酸鹽培養(yǎng)基上產(chǎn)生杯狀凹陷。

2.2 病原菌的致病性測(cè)定

接種的10株煙草（其中苗期5株，成株期5株）均先后發(fā)病。發(fā)病最快的接種后第三天即出現(xiàn)與田間感染病株相同癥狀（圖2）。對(duì)照煙苗未見發(fā)病。根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行回接試驗(yàn)，證明所分離病原菌是煙草空莖病致病菌。

2.3 病原菌的部分生物學(xué)特性

病原菌生物學(xué)特性的生理生化測(cè)定結(jié)果（表1）顯示，所分離病菌能在5%鹽濃度下生長(zhǎng)，能在37 ℃下生長(zhǎng)，利用蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸，兼性厭氧，也能利用檸檬酸鹽，但不能產(chǎn)生吲哚。這些特性與黃俊斌等[7]所鑒定的魔芋軟腐病病原菌的特性以及東秀珠等[8]對(duì)胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora）的描述相一致。

3 結(jié)論

根據(jù)病原菌分離物的菌體形態(tài)特征及部分生理生化特性，對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和參考文獻(xiàn)[9]描述的特征，可以初步確定導(dǎo)致五峰馬里蘭煙感染空莖病的病原菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種（胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜亞種， Erwinia carotovora subsp. carotovora， Ecc）[10]，與文獻(xiàn)[11]的報(bào)道一致。經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病原分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室對(duì)分離物進(jìn)行16 S rDNA 序列測(cè)定及NCBI Blast比對(duì)，其序列與Pectobacterium carotovorum subsp. Carotovorum菌株相似度為99%，進(jìn)一步確認(rèn)五峰馬里蘭煙空莖病的病原菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種。

參考文獻(xiàn)：

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