摘要：以脫脂紫蘇（Perilla frutescens）葉和莖為原料，采用堿溶酸沉法制備紫蘇蛋白質(zhì)。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究并優(yōu)化紫蘇蛋白質(zhì)的提取工藝條件。結(jié)果表明，紫蘇蛋白質(zhì)的最佳制備工藝條件為堿提pH 8.0、料液比1∶10（m/V，g∶mL）、堿提溫度40 ℃、酸沉pH 4.0，在此條件下，紫蘇蛋白質(zhì)提取率為20.51%；在最佳工藝條件下，采用100 W的超聲波輔助提取，蛋白質(zhì)提取率為22.41%。

關(guān)鍵詞：紫蘇（Perilla frutescens）；堿溶酸沉法；蛋白質(zhì)提取工藝

中圖分類號(hào)：TQ936.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）16-3951-03

紫蘇（Perilla frutescens）是一種獨(dú)特的油料保健作物，含油率一般為30%～51%，粗蛋白含量約為20%～23%，主要用于榨取紫蘇油[1]。隨著紫蘇的大面積種植和紫蘇產(chǎn)品的開發(fā)利用，人們對(duì)紫蘇的研究范圍越來(lái)越廣泛。目前對(duì)紫蘇成分的研究主要集中在紫蘇氨基酸組成、藥理作用、產(chǎn)品的開發(fā)利用等方面，而對(duì)于紫蘇蛋白質(zhì)分離提取的研究卻少有報(bào)道，紫蘇中含有大量的蛋白質(zhì)卻未被好好地加以利用。紫蘇中的氨基酸組成比較全面，種類達(dá)18種，除含硫氨基酸（蛋氨酸、胱氨酸）偏低外，其他氨基酸組成與其他植物沒有差別[2，3]。紫蘇作為一種新興的植物蛋白質(zhì)資源，研究其提取工藝是有效開發(fā)利用紫蘇蛋白質(zhì)的前提條件。試驗(yàn)以用石油醚脫脂后的紫蘇葉以及莖為原料，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究紫蘇蛋白質(zhì)提取的最佳提取工藝條件，充分利用了紫蘇中的蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步開發(fā)利用紫蘇資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 紫蘇由中華大藥房提供，蛋白質(zhì)含量為27.8%。牛血清白蛋白（BSA），95%的乙醇，85%的磷酸，考馬斯亮藍(lán)溶液，石油醚（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、濃鹽酸等（分析純）。

1.1.2 儀器與設(shè)備 PHS-3C型數(shù)顯酸度計(jì)、TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)、22型可見光分光光度計(jì)、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)式真空泵、TDA溫度控制儀（恒溫水浴鍋）、電熱恒溫干燥箱、FA2104S電子分析天平、容量瓶等。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[4]。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取0.25 g牛血清白蛋白溶于25 mL去離子水中，即為10 mg/mL的原液?？捡R斯亮藍(lán)G-250試劑：稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，溶于50 mL 95%的乙醇中，加入85%的磷酸100 mL，最后用去離子水定容到1 000 mL。取7支試管，使蛋白質(zhì)濃度分別為0、1、2、4、6、8、10 mg/mL，向每支試管中加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，靜置2 min后測(cè)定各組蛋白質(zhì)溶液的吸光度，并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2 紫蘇葉分離蛋白的制取工藝 干紫蘇葉→低溫冷凍→研磨→加石油醚脫脂→濾渣→自然風(fēng)干→加堿浸提→過濾、離心→蛋白質(zhì)提取液→酸沉→水洗中和沉淀→干燥→粗蛋白[5]。

1.2.3 蛋白質(zhì)提取率的計(jì)算 蛋白質(zhì)提取率=分離的蛋白質(zhì)的質(zhì)量/原料的質(zhì)量×100%。

1.2.4 超聲波對(duì)紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響 在最佳工藝條件下，將裝有溶液的小燒杯放在100 W、50 ℃下超聲波清洗器中振蕩提取30 min，確定超聲波對(duì)紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.2.5 單因素試驗(yàn) ①堿提pH對(duì)紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1 g脫脂紫蘇葉，按1∶15（m/V，g∶mL）的料液比分別加入pH 7.0、8.0、9.0、10.0的氫氧化鈉溶液，在50 ℃條件下攪拌浸提30 min，后將溶液進(jìn)行抽濾得濾液，將濾液用1 mol/L的HCl溶液沉淀靜置30 min，再離心得粗蛋白，烘干后再稱量，考察最佳堿提pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。②料液比對(duì)紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1 g脫脂紫蘇葉，分別按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（m/V，g∶mL，下同）的料液比加入pH 9.0的氫氧化鈉溶液，在50 ℃條件下制備粗蛋白，獲得料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。③堿提溫度對(duì)紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1 g脫脂紫蘇葉，按1∶15的料液比加入pH 9.0的氫氧化鈉溶液，分別在堿提溫度為30、40、50、60 ℃的條件下制備粗蛋白，研究堿提溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。④酸沉pH對(duì)紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1 g脫脂紫蘇葉，按1∶15的料液比加入pH 9.0的氫氧化鈉溶液，在50 ℃條件下攪拌浸提30 min，在pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0的條件下制備粗蛋白，研究酸沉pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.2.6 正交試驗(yàn) 在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，以溶液中蛋白質(zhì)提取率作為衡量指標(biāo)，研究采用堿溶酸沉法提取紫蘇蛋白質(zhì)的最佳工藝條件，因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

試驗(yàn)過程中在波長(zhǎng)為595 nm下測(cè)得蛋白質(zhì)濃度與吸光度的關(guān)系見表2。依此繪制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得到標(biāo)準(zhǔn)方程為■=0.051 4x+0.055 9，r=0.990 4。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 堿提pH對(duì)紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖2可知，隨著pH的增加，蛋白質(zhì)提取率先增加。當(dāng)溶液的pH為9.0時(shí)，紫蘇葉分離蛋白質(zhì)的提取率為16.23%，達(dá)到最大。此后再增加提取液的pH，蛋白質(zhì)提取率降低。因此用堿溶酸沉法提取紫蘇蛋白質(zhì)的最佳堿提pH為9.0。

2.2.2 料液比對(duì)紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖3可知，隨著料液比的減小，蛋白質(zhì)提取率先增加后降低。合適的料液比可降低體系的黏度、增大濃度梯度、加快傳質(zhì)過程，因而提取率高；但料液比過低，紫蘇葉分離蛋白質(zhì)的提取率并沒有明顯增加，反而會(huì)增加后處理的負(fù)擔(dān)。因此用堿溶酸沉法提取紫蘇蛋白質(zhì)的最佳料液比為1∶15。

2.2.3 堿提溫度對(duì)紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖4可知，在一定的堿提溫度范圍內(nèi)，隨著堿提溫度升高，紫蘇蛋白質(zhì)的提取率也隨之升高，50 ℃時(shí)提取率最高，為16.22%，但是當(dāng)堿提溫度超過50 ℃，蛋白質(zhì)的提取率反而下降。因?yàn)閴A提溫度越高，越有利于蛋白質(zhì)的溶出，當(dāng)堿提溫度超過50 ℃，由于淀粉糊化作用反而會(huì)降低蛋白質(zhì)的提取率；另外，堿提溫度過高容易使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，影響最終產(chǎn)品的特性。因此用堿溶酸沉法提取紫蘇蛋白質(zhì)的最佳堿提溫度為50 ℃。

2.2.4 酸沉pH對(duì)紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖5可知，酸沉階段紫蘇蛋白質(zhì)的提取率隨pH的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)，在pH 5.0時(shí)提取率達(dá)到最大。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在某一種pH的溶液中，它所帶的正電荷數(shù)與負(fù)電荷數(shù)恰好相等，即凈電荷數(shù)為零，此時(shí)蛋白質(zhì)間靜電荷排斥作用最低，蛋白質(zhì)聚集、沉淀，溶解度最低，從溶液中析出。因此用堿溶酸沉法提取紫蘇蛋白質(zhì)的最佳酸沉pH為5.0。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，各因素對(duì)紫蘇蛋白質(zhì)提取率的影響主次為料液比>酸沉pH>堿提溫度>堿提pH，即在堿提過程中料液比影響最大，其次為酸沉pH和堿提溫度，堿提pH對(duì)提取率的影響最小。從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，最優(yōu)組合為A1B1C1D1。綜合各因素的作用，得出適于本工藝的最佳浸提條件是堿提pH 8.0、堿提溫度40 ℃、料液比1∶10、酸沉pH 4.0。在上述條件下蛋白質(zhì)提取率可達(dá)到20.51%。

2.4 超聲波對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

采用紫蘇葉分離蛋白質(zhì)的最佳提取工藝條件為堿提pH 8.0、堿提溫度40 ℃、料液比1∶10、酸沉pH 4.0，在浸提過程中增加100 W的超聲波振蕩提取，做兩組平行試驗(yàn)，紫蘇葉分離蛋白質(zhì)的提取率最高可達(dá)22.41%。超聲波的“空化效應(yīng)”增加了紫蘇蛋白質(zhì)的提取率；超聲波引起溶劑的機(jī)械振動(dòng)，可以加快熱傳遞，使溶劑受熱均勻，使溶質(zhì)整體受熱均勻，同時(shí)加快了溶質(zhì)分散，也加快了溶解。

3 結(jié)論

影響紫蘇中蛋白質(zhì)提取率的因素的影響程度由大到小依次是料液比、酸沉pH、堿提溫度、堿提pH。其中堿提溫度、料液比和酸沉pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響顯著，堿提pH對(duì)紫蘇葉中蛋白質(zhì)的提取率影響不顯著。紫蘇葉蛋白質(zhì)的最佳提取條件是堿提pH 8.0、堿提溫度40 ℃、料液比1∶10、酸沉pH 4.0，在此條件下蛋白質(zhì)提取率可達(dá)到20.51%。在提取過程中添加100 W的超聲波處理會(huì)明顯增加蛋白質(zhì)的提取率，此條件下紫蘇蛋白質(zhì)的提取率可達(dá)到22.41%。

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