摘要： 為研究提取因素對煙草中游離煙堿的提取得率的影響。在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇提取溶劑中液料比、提取時間、提取溫度和搖床轉(zhuǎn)速，進行4因素3水平Box-Behnken試驗設(shè)計，采用響應(yīng)面法（RSM）分析了4個因素對響應(yīng)值（游離煙堿得率）的影響。結(jié)果表明，水提取-有機溶劑萃取法提取煙草中游離煙堿的最優(yōu)條件如下： 液料比30∶1（V/m，mL/g），提取時間33 min，搖床轉(zhuǎn)速212 r/min和提取溫度34 ℃。在最優(yōu)的條件下進行了5次驗證試驗，游離煙堿的平均得率為7.01 mg/g，與理論值（6.98 mg/g）的誤差為0.43%，說明該優(yōu)化方法可行。

關(guān)鍵詞：煙草；游離煙堿；提??；響應(yīng)面優(yōu)化

中圖分類號：S572 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3922-04

煙堿是煙草中的一種特殊的生物堿，以游離態(tài)、質(zhì)子態(tài)兩種形態(tài)存在[1]。卷煙的品質(zhì)和勁頭不僅與煙草及主流煙氣中的煙堿總含量有關(guān)，與煙堿形態(tài)也有著密切的關(guān)系，游離態(tài)煙堿易揮發(fā)，主要以氣相形態(tài)存在，易于穿透口腔黏膜從而更快速地被人體吸收，能對中樞神經(jīng)產(chǎn)生強烈的作用，抽吸時具有較強的勁頭[2，3]，而質(zhì)子態(tài)煙堿被口腔吸收的相對慢一點，抽吸時勁頭較弱。所以針對不同形態(tài)的煙堿進行研究和測定是十分必要的。

煙草中煙堿與有機酸結(jié)合所形成的鹽類為極易解離的弱酸弱堿鹽，因而要準(zhǔn)確測定煙草中游離態(tài)煙堿的絕對含量有一定的難度，其提取方法是至關(guān)重要的[4]。目前煙草中游離煙堿含量的提取和測定方法各異，測定結(jié)果也有所不同，為得到一個穩(wěn)定而準(zhǔn)確的可以用于長期檢測的方法，筆者根據(jù)前期試驗和參考文獻[5，6]，利用響應(yīng)面法[7]優(yōu)化了煙草游離煙堿提取條件，旨在為煙草煙堿形態(tài)對煙草品質(zhì)的影響提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

煙堿（純度大于98%，0 ℃下保存）；正十七烷（純度大于99%，New Jersey USA）；三氯甲烷（色譜純，北京化工廠）；氫氧化鈉（AR，天津市科密毆化學(xué)試劑開發(fā)中心）；煙葉（石家莊卷煙廠提供）；BS-4GBS-4G全溫振蕩培養(yǎng)箱（江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司）；6890GC/5973MS氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）。

1.2 試驗方法

煙草中游離煙堿的測定[5]：稱取約1 g樣品，放入150 mL的具塞三角瓶中，加入30 mL用0.01 mol/L的NaOH水溶液調(diào)節(jié)至pH 7.00的去CO2蒸餾水，在室溫下振蕩萃取0.5 h，過濾，取濾液15 mL至250 mL分液漏斗中，用三氯甲烷（含內(nèi)標(biāo)： 正十七烷）萃取2次，每次20 mL，合并有機相，作為氣相色譜分析。采用內(nèi)標(biāo)-工作曲線法對氣相色譜鑒定出的游離煙堿進行定量。

1.3 響應(yīng)曲面（RSM） 試驗設(shè)計

1.3.1 單因素試驗 按文獻[5]考察液料比、提取時間、提取溫度和搖床轉(zhuǎn)速等因素對游離煙堿提取率的影響。

1.3.2 響應(yīng)面分析法試驗設(shè)計 根據(jù)筆者前期試驗[5]，選取液料比、提取時間、提取溫度和搖床轉(zhuǎn)速為關(guān)鍵影響因子， 采用Box-Behnken設(shè)計，因子水平及編碼見表1。以游離煙堿得率為評價指標(biāo)。數(shù)據(jù)分析及模型建立由Design Expert （Version 7.1.3）軟件完成。該模型利用最小二乘法擬合響應(yīng)值與自變量之間的關(guān)系方程： y=B0+B1x1+B2x2+B3x3+B4x4+B12x1x2+B13x1x3+B14x1x4+B23x2x3+B24x2x4+B34x3x4+B11x12+B22x22+B33x32+B44x42，式中：y為響應(yīng)值， B0為常數(shù)項，B1、B2、B3、B4分別為線性系數(shù)，B12、B13、B14、B23、B24、B34為交互項系數(shù)，B11、B22、B33、B44為二次項系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

通過單因素試驗結(jié)果可知，當(dāng)液料比為30∶1、時間為30 min、溫度為40 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時，游離煙堿的提取效果較好。

2.2 響應(yīng)面分析試驗結(jié)果

2.2.1 多元二次方程的建立 根據(jù)單因素的液料比、提取時間、提取溫度和搖床轉(zhuǎn)速4個單因素試驗結(jié)果，確定響應(yīng)面試驗各因素的水平范圍。采用Design-Expert軟件為輔助手段設(shè)計響應(yīng)面試驗，選用Box-Behnken模型（BBD）設(shè)計進行了29組試驗，其結(jié)果見表2。

2.2.2 模型方程的建立與顯著性檢驗

利用Design-Expert7.1.3軟件，通過表2中游離煙堿提取率試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得游離煙堿提取率對編碼自變量液料比、提取時間、提取溫度和搖床轉(zhuǎn)速的二次多項回歸方程：

y=6.77+0.18x1+0.029x2+0.10x3-0.67x4+0.073x1x2+0.18x1x3-0.36x1x4-0.37x2x3+0.13x2x4-0.39x3x4-0.60x12-0.36x22-0.53x32-0.80x42

對上述回歸模型進行方差分析，結(jié)果表明，總回歸達到極顯著水平，說明本試驗與所選因素之間存在極顯著的回歸關(guān)系，試驗設(shè)計方案正確。

由表3可以看出，該模型F=32.39，P<0.01，表明模型極顯著，不同處理可導(dǎo)致不同的響應(yīng)。失擬項F=4.71，P=0.072 4，模型失擬不顯著。模型的決定系數(shù)R2=0.963 0，說明該模型與實際試驗擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著；而調(diào)整決定系數(shù)R2=0.926 0，說明響應(yīng)值的變化有92.6%來源于所選變量，即液料比、提取時間、提取溫度和搖床轉(zhuǎn)速。因此，該回歸方程對試驗擬合情況較好，試驗誤差小，可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系。

從系數(shù)項的P值來分析，方程的一次項（x1、x4）、二次項（x12、x22、x32、x42）、交互項（x1x4、x2x3、x3x4）都達到極顯著水平（P<0.01），說明各具體試驗因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。游離煙堿提取率與試驗因子之間存在極顯著的回歸關(guān)系，其優(yōu)化的方程為：

y=6.77+0.18x1-0.67x4-0.36x1x4-0.37x2x3-

0.39x3x4-0.60x12-0.36x22-0.53x32-0.80x42

通過游離煙堿提取率的二次多項數(shù)學(xué)模型解逆矩陣，得最優(yōu)萃取工藝條件：提取時間33.17 min、液料比29.36∶1、搖床轉(zhuǎn)速212.46 r/min和提取溫度34.49 ℃。在此條件下，游離煙堿提取率理論值可達6.98 mg/g。考慮到實際操作的局限性，同時達到節(jié)省時間、節(jié)約試劑、萃取效果好的目的，將游離煙堿提取工藝條件修正為：提取時間33 min、液料比30∶1、搖床轉(zhuǎn)速212 r/min和提取溫度34 ℃。在此條件下再次進行5次平行驗證試驗，游離煙堿的平均得率為7.01 mg/g，與理論值（6.98 mg/g）的誤差為0.43%，兩者吻合較好， 說明模型可行。

2.2.3 游離煙堿提取工藝的響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

由回歸方程所作的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖如圖3、圖4、圖5所示。通過該組動態(tài)圖可評價試驗因子對游離煙堿提取率的兩兩交互作用，以及確定各個因素的最佳水平范圍。等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著[7]。

由圖3、圖4、圖5可知，搖床轉(zhuǎn)速、液料比是影響游離煙堿提取率的最顯著因素，表現(xiàn)為等高曲線陡峭；提取溫度和提取時間次之，表現(xiàn)為等高曲線較平滑，說明提取溫度和提取時間對響應(yīng)值影響較小。

由圖3 可知， 在溫度為30～42 ℃時，提取時間為24～40 min 時，游離煙堿提取率較大。提取時間比溫度對游離煙堿提取量的影響大。隨著提取時間的增大，游離煙堿提取量在不斷增大，當(dāng)提取溫度在一定范圍內(nèi)（<42 ℃），游離煙堿提取量隨著時間的增加不斷增大，而當(dāng)溫度繼續(xù)增大時，游離煙堿提取率反而減少。

由圖4可知， 在轉(zhuǎn)速為170～235 r/min時，液料比為（26～34）∶1 （mL∶g） 時，游離煙堿提取率較大。轉(zhuǎn)速較液料比對游離煙堿提取量的影響大。隨著轉(zhuǎn)速的增大，游離煙堿提取量在不斷增大，當(dāng)提取轉(zhuǎn)速在一定范圍內(nèi)（<170 r/min），游離煙堿提取量隨著液料比的增加不斷增大， 而當(dāng)轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大時，游離煙堿提取率反而減少。

由圖5可知， 在轉(zhuǎn)速為160～250 r/min時， 溫度為30～44 ℃時， 游離煙堿提取率較大，可達6.496 6 mg/g以上。轉(zhuǎn)速比溫度對游離煙堿提取量的影響大。隨著轉(zhuǎn)速的增大，游離煙堿提取量不斷增大，當(dāng)轉(zhuǎn)速在一定范圍內(nèi)（<160 r/min），游離煙堿提取量隨著溫度的增加不斷增大，而當(dāng)轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大時，游離煙堿提取率反而減少。

3 結(jié)論

1）在單因素試驗的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)化水-有機溶劑提取煙草中游離煙堿的條件?；貧w分析結(jié)果表明，搖床轉(zhuǎn)速和液料比對游離煙堿得率的影響顯著；時間與溫度，轉(zhuǎn)速和液料比，轉(zhuǎn)速和溫度的交互項對游離煙堿得率影響高度顯著。

2）游離煙堿得率響應(yīng)方程的回歸分析和驗證試驗表明本研究方法合理可行。用水-有機溶劑從煙草中提取游離煙堿的最佳條件為液料比30∶1，提取時間33 min，搖床轉(zhuǎn)速212 r/min和提取溫度34 ℃，游離煙堿的平均得率為7.01 mg/g，與預(yù)測值（6.98 mg/g）的誤差為0.43%。

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