摘要：對(duì)東北蒲公英（Taraxacum. ohwianum Kitam.）染色體的核型和花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂行為進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，東北蒲公英染色體為二倍體，染色體數(shù)2n=16，核型公式K（2n）=2x=16=10 m+6 sm，屬于2A型，并觀察到有隨體存在。東北蒲公英的造孢細(xì)胞存在大量染色體的特殊情況可能是花粉母細(xì)胞的一種獨(dú)特形成途徑。此外在終變期只觀察到單價(jià)體，在中后期Ⅱ染色體拉向兩極不明顯，這與在高等植物中描述的減數(shù)分裂行為并不完全一致。東北蒲公英四分體為非連續(xù)型胞質(zhì)分離，產(chǎn)生了均勻一致的小孢子。

關(guān)鍵詞：東北蒲公英（Taraxacum. ohwianum Kitam.）；染色體；核型；花粉母細(xì)胞；減數(shù)分裂

中圖分類號(hào)：S567.21；Q343.2；Q253 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）16-3895-04

東北蒲公英（Taraxacum. ohwianum Kitam.）是菊科（Asteraceae）蒲公英屬（Taraxacum F. H. Wigg.）植物，也是菊科舌狀花亞科（Subfam. Liguliflorae DC.）最進(jìn)化的類群之一[1]。蒲公英屬全世界約有300多種。中國(guó)高等植物數(shù)據(jù)庫(kù)中已記錄的、在中國(guó)分布的有79個(gè)種（包括7個(gè)存疑種），廣泛分布于中國(guó)的東北、華北、西北及西南各省（區(qū)），其中東北地區(qū)為蒲公英的主產(chǎn)區(qū)[2，3]。東北蒲公英在東北地區(qū)有廣泛的分布，但在收集種子的過程中，發(fā)現(xiàn)東北蒲公英經(jīng)常產(chǎn)生敗育的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象是產(chǎn)生此次試驗(yàn)的動(dòng)因。蒲公英屬植物的染色體從2x到10x不等，以3x居多；其二倍體進(jìn)行有性生殖[4]，但多倍體中也存在兼性無融合生殖的情況[5]，由此造成種子敗育的原因不能確定。所以試驗(yàn)以東北蒲公英為材料，采用根尖壓片確定其體細(xì)胞染色體數(shù)目，通過分析其核型和花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中染色體的行為與變異來判斷東北蒲公英的倍性水平，并進(jìn)一步分析其種子敗育的原因。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討東北蒲公英雜交親本的育性，以指導(dǎo)遺傳育種工作，尤其在確定種間雜交組合、誘變育種等方面具有重要的指導(dǎo)意義，可為東北蒲公英的品種選育、雜交后代和新品種的鑒定、分類、推廣提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

東北蒲公英于2008年采集于遼寧省丹東市，栽種于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)百草園中草藥試驗(yàn)基地內(nèi)，常規(guī)管理。供試材料于2011年5月在田間采集新鮮植株，抖凈泥土后自來水沖洗至沒有附著物，晾干。將全株樣品交由中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)生態(tài)研究所李冀云研究員鑒定，確認(rèn)是東北蒲公英無疑。

1.2 核型分析方法

核型分析采用根尖壓片法。取東北蒲公英根長(zhǎng)0.5 cm左右的前端部分，于觀察日的9：00～11：00放入八羥基喹啉溶液中4 h，然后把根尖轉(zhuǎn)移到卡諾固定液（冰乙酸∶無水乙醇=1∶3）中固定12 h以上，取出后保存在70%乙醇中（可長(zhǎng)期保存）。用1 mol/L HCl在60 ℃的水浴中解離根尖樣品15 min，去離子水沖洗3次后， 卡寶品紅染色24 h以上，取根尖1～2 mm部分（分生組織）壓片觀察，中性樹膠封片。在Olympus光學(xué)顯微鏡下選取若干個(gè)染色體分散良好、著絲點(diǎn)清晰的根尖細(xì)胞進(jìn)行核型分析[6]與核型分類[7]，并照相。

1.3 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的觀察方法

花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的觀察采用花藥壓片法。于2011年4月底到5月初這段時(shí)間隔天在取樣日的9：30～11：30取東北蒲公英未開的花蕾（直徑0.2～2.0 cm）， 迅速帶回實(shí)驗(yàn)室將花蕾在卡諾固定液中固定24 h，再轉(zhuǎn)入70%的乙醇中，置4 ℃冰箱內(nèi)保存。制片前取出花蕾樣品，用去離子水清洗3次， 晾干后將花蕾用消毒后的鑷子撕開，最好別損壞里面的小花結(jié)構(gòu)。在操作臺(tái)上用鑷子于花序中鑷取3～5朵小舌狀花放于載玻片上，用消毒針將上半部分花冠去掉，只留下半部分的聚藥雄蕊，然后置于酶液（4%纖維素酶與1%果膠酶混合液，用檸檬酸緩沖液溶解）中，在37 ℃水浴鍋中酶解120～150 min，再用去離子水清洗3次后將花藥從中部切開，用鑷子輕輕擠壓，采用卡寶品紅染色法制片，火焰微烤分色，用Olympus光學(xué)顯微鏡鏡檢，統(tǒng)計(jì)并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 核型分析

東北蒲公英的染色體為二倍體，試驗(yàn)中觀察到的根尖細(xì)胞染色體數(shù)均為16。用Motic Camera專業(yè)圖像分析軟件對(duì)5個(gè)根尖細(xì)胞典型的中期染色體進(jìn)行長(zhǎng)度測(cè)量并計(jì)算出核型參數(shù)，結(jié)果見表1。從表1可見，東北蒲公英染色體的核型公式K（2n）=2x=16=10 m+6 sm；染色體組總長(zhǎng)為80.4，臂比值大于2的染色體占染色體總數(shù)的12.5%，最長(zhǎng)染色體（6.6）與最短染色體（4.1）的比值為1.61（<2∶1），核型分類為2A型。東北蒲公英的根尖細(xì)胞染色體形態(tài)見圖1，染色體核型見圖2，染色體核型模式見圖3。

2.2 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察結(jié)果

2.2.1 孢原細(xì)胞 東北蒲公英花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察結(jié)果見圖4。從圖4可見，孢原細(xì)胞分裂旺盛，體積較大，核大于周圍的其他細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)也較濃。圖4-1、圖4-2、圖4-3、圖4-4為不同染色體數(shù)目的孢原細(xì)胞，這些孢原細(xì)胞大小不一，染色體數(shù)目差異非常大，數(shù)量從幾百條到幾十條不等，這與根尖染色體數(shù)目明顯不同。圖4-5、圖4-6、圖4-7為不同細(xì)胞核數(shù)目的孢原細(xì)胞，數(shù)量從2～5不等。在觀察過程中還發(fā)現(xiàn)了大量的不完整孢原細(xì)胞出現(xiàn)的現(xiàn)象，如圖4-3那樣，有一部分染色體分離了出去，就像原始細(xì)胞的裂解方式一樣。圖4-8是裂解后形成的造孢細(xì)胞，而后進(jìn)行減數(shù)分裂。

2.2.2 第一次減數(shù)分裂 在減數(shù)分裂前期Ⅰ的細(xì)線期，花粉母細(xì)胞的核仁里出現(xiàn)解體，著色能力越來越弱。此時(shí)的染色質(zhì)螺旋化形成長(zhǎng)細(xì)絲狀的染色體，呈“花束”狀形態(tài)（圖4-9）。至粗線期時(shí)，染色體逐漸縮短變粗，直到終變期（圖4-10），同源染色體還沒有配對(duì)，仍然是16條染色體。這與大多數(shù)植物在粗線期完成同源染色體的配對(duì)明顯不同，說明東北蒲公英的同源染色體配對(duì)要明顯滯后于其他植物；此時(shí)染色體還保持單價(jià)體的狀態(tài)。在后期Ⅰ（圖4-11）染色體分離，其后可以觀察到2個(gè)子細(xì)胞之間沒有明顯的細(xì)胞板分隔（圖4-12），因此東北蒲公英花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂為非連續(xù)性胞質(zhì)分裂類型。

2.2.3 第二次減數(shù)分裂 到前期Ⅱ（圖4-13）細(xì)胞核開始解體，形成染色體，從中可以看出2個(gè)細(xì)胞核的解體速度并不一致。后期Ⅱ（4-14）觀察到姐妹染色單體的分離，隨后染色單體開始解螺旋，又重新形成染色體（圖4-15）。染色體進(jìn)一步分離到子細(xì)胞的兩極（圖4-16、圖4-17），當(dāng)新的核膜、核仁開始形成時(shí)即進(jìn)入末期Ⅱ。在末期Ⅱ（圖4-18）形成四分體，隨著核與核之間細(xì)胞壁的形成，出現(xiàn)十字型四分體（圖4-19）。不斷發(fā)育的小孢子因胼胝質(zhì)壁逐漸解體消失，而被釋放到花藥腔中（圖4-20）。

3 討論

翟大彤等[8]研究表明，蒲公英屬植物的染色體數(shù)為2n=18、22、24、26、32、34、36、37；而其對(duì)東北蒲公英的核型分析結(jié)果與王守軍等[9]、王艷等[10]對(duì)蒲公英的核型分析支持x=8的結(jié)論一致。蒲公英屬植物通常具有無融合現(xiàn)象，一般高倍性的物種可進(jìn)行無融合生殖、低倍性的物種進(jìn)行有性生殖[11]。東北蒲公英的染色體為二倍體（2n=16），那么它應(yīng)該進(jìn)行有性生殖、異交并具有孢子體自交不親和系統(tǒng)存在[4，12]。這在雜交育種上確定雜交組合時(shí)，就應(yīng)以東北蒲公英為母本、其他蒲公英做父本來完成雜交試驗(yàn)。

花粉母細(xì)胞由孢原細(xì)胞發(fā)育而來；但在此次試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)有些孢原細(xì)胞存在大量染色體的現(xiàn)象，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過根尖細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)的16條，出現(xiàn)孢原細(xì)胞的染色體數(shù)目多于正常的16條染色體可能是由于細(xì)胞的裂解所造成的，孢原細(xì)胞染色體在裂解后形成細(xì)胞核，繼而分裂開來。孢原細(xì)胞究竟是形成細(xì)胞核后裂解、還是形成染色體后再裂解、或者兩種方式兼而有之還需要進(jìn)一步通過試驗(yàn)來證明。由于在試驗(yàn)中經(jīng)常觀察到染色體缺失的情況，所以我們更傾向于形成染色體后再裂解。但這些含有大量染色體的孢原細(xì)胞是怎么形成的、又是如何精確調(diào)控染色體分離的、這種現(xiàn)象在蒲公英屬植物中是否普遍存在等問題，需要進(jìn)一步詳細(xì)試驗(yàn)來解釋。

Atlagic等[13]認(rèn)為，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂過程與花粉育性具有相關(guān)性；Luan等[14]發(fā)現(xiàn)染色體配對(duì)正常時(shí)，會(huì)得到比較高的花粉育性及結(jié)實(shí)率。試驗(yàn)過程中東北蒲公英的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂可形成單價(jià)體，但未觀察到雙價(jià)體或者三價(jià)體，這與Peter等[15]對(duì)二倍體的蒲公英（Taraxacum officinale L.）減數(shù)分裂觀察到的在前期Ⅰ形成8條二價(jià)體的結(jié)果并不一致。形成16條單價(jià)體的原因可能為同源染色體沒有發(fā)生聯(lián)會(huì)，二價(jià)體提早分離；或許是不規(guī)則聯(lián)會(huì)，即幾條染色體（并非兩同源染色體）不規(guī)則地聯(lián)在一起等造成的。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，形成的單價(jià)體能正常分離，因此認(rèn)為東北蒲公英形成單價(jià)體的主要原因是同源染色體沒有發(fā)生聯(lián)會(huì)造成的。正因?yàn)槿绱?，所以在后期可能出現(xiàn)不正常的分離，從而影響東北蒲公英花粉的育性。Khazanehdari等[16]也發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂中期單價(jià)體會(huì)引起后期的不均等分離，從而降低花粉育性。根據(jù)我們對(duì)離體花粉萌發(fā)的研究，東北蒲公英的花粉活性在60%左右，這也佐證了東北蒲公英的花粉發(fā)育存在一些異常的情況。

參考文獻(xiàn)：

[1] 龔祝南，張衛(wèi)明，劉常宏，等.中國(guó)蒲公英屬植物資源[J].中國(guó)野生植物資源，2001，20（3）：9-14，5.

[2] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1999.

[3] 李冀云.東北草本植物志[M].北京：科學(xué)出版社，2004.

[4] RICHARDS A J. The origin of Taraxacum agamospecies [J]. Botanical Journal of Linnean Society，1973，66：189-211.

[5] JENNISKENS J P J， WETZELS P C J， STERK A A. Aspects of the flowering ecology of taxa of Taraxacum sect[J]. Bot Jahrb Syst Planzengesch Planzengeogr，1984，104：369-400.

[6] 李懋學(xué)，陳瑞陽(yáng).關(guān)于植物核型分析的標(biāo)準(zhǔn)化問題[J].武漢植物學(xué)研究，1985，3（4）：297-302.

[7] STEBBINS G L. Chromosomal evolution in higher plants[M]. London：Edward Arnod Lid，1971.

[8] 翟大彤，安爭(zhēng)夕，譚敦炎.新疆蒲公英屬有性生殖與無融合生殖植物的調(diào)查研究[J].西北植物學(xué)報(bào)，1997，17（1）：1-7.

[9] 王守軍，楊曉杰，葛繼榮，等.3種蒲公英的核型與進(jìn)化[J].高師理科學(xué)刊，2007，27（6）：49-52.

[10] 王 艷，閏麗梅，關(guān)雅靜，等.戟片蒲公英的核型研究[J]. 齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，14（4）：58-60.

[11] DIJK P J V， BAARLEN P V， JONG J H D. The occurrence of phenotypically complementary apomixis recombinants in crosses between sexual and apomictic dandelions（Taraxacum officinale）[J]. Sexual Plant Reproduction，2003，16：71-76.

[12] RICHARDS A J. Plant breeding systems[M]. New York：Chapman and Hall，USA，1986.

[13] ATLAGIC J， DOZET B， KORIC S. Meiosis and pollen viability in Helianthus tuberosus L. and its hybrids with cultivated sunflower [J]. Plant Breeding，1993，111：318-324.

[14] LUAN L， TU S B， LONG W B， et al. Cytogenetic studies on two F1 hybrids of autotetraploid rice varieties showing extremely high level of heterosis [J]. Plant Systematics and Evolution，2007，267：205-213.

[15] PETER VAN B， PETER J VAN D， ROLF F H， et al. Meiotic recombination in sexual diploid and apomictic triploid dandelions（Taraxacum officinale L.）[J]. Genome，2000，43：827-835.

[16] KHAZANEHDARI K A， JONES G H. The causes and consequences of meiotic irregularity in the leek（Allium ampeloprasum spp. Porrum）； implications for fertility[J]. Euphytica，1997，93：313-319.