【摘 要】目的:探討黃連提取物影響細(xì)菌內(nèi)毒素的作用。方法:以細(xì)菌內(nèi)毒素為致熱原,觀察三種不同劑量(0.10g/kg,0.08g/kg,0.06g/kg)的黃連提取物對(duì)內(nèi)毒素所致家兔發(fā)熱的影響;另外,以2EU/ml的內(nèi)毒素溶液給小鼠腹腔注射,觀察三組不同劑量的黃連提取物對(duì)內(nèi)毒素所致小鼠死亡的保護(hù)作用。結(jié)果:黃連提取物三個(gè)劑量組的家兔平均體溫變化要明顯低于空白組;與空白組相比,黃連提取物三個(gè)劑量組的小鼠死亡率均明顯降低,且小鼠的平均死亡時(shí)間均明顯延長。結(jié)論:黃連提取物對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素導(dǎo)致家兔發(fā)熱有明顯的解熱作用;對(duì)2EU/ml的內(nèi)毒素所致小鼠死亡有較好的保護(hù)作用,并可明顯延長小鼠的死亡時(shí)間。
【關(guān)鍵詞】 黃連提取物;抗細(xì)菌內(nèi)毒素
【中圖分類號(hào)】 R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 B
黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinernsis Franch.、三角葉黃連Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao.或云連Coptis teeta Wall.的干燥根莖,具有清熱燥濕,瀉火解毒的功能?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明,黃連的活性作用主要與其根莖所含的生物堿(約占根莖的4%~8%)有關(guān),包括小檗堿(berberine)、黃連堿(coptisine),甲基黃連堿(worenine)、巴馬亭(palmatine)、藥根堿(jatrorrhizine)、表小檗堿(epiberberine)、木蘭花堿(mognoflorine),及中藥炮制過程中由小檗堿轉(zhuǎn)化而來的9-去甲小檗堿(berberrubine)等。黃連的主要活性成分是小檗堿,以鹽酸鹽的形式存在于黃連中,是一種異喹啉類生物堿,它具有抗菌,抗炎及抗腹瀉作用.千百年來它一直被廣泛用于治療皮膚炎癥,肝炎,腹瀉及其它炎癥[1,2]。研究發(fā)現(xiàn),同只用抗生素相比,小檗堿和抗生素聯(lián)用能明顯提高抑菌活性[3-4]。然而,黃連提取出的生物堿抗菌消炎機(jī)制尚不明確,其治療感染性疾病的機(jī)制可能是其通過影響細(xì)菌內(nèi)毒素的活性從而發(fā)揮抗炎作用的。
內(nèi)毒素(endotoxin)是革蘭式陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的主要組成成分,其化學(xué)本質(zhì)為脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),是誘發(fā)炎癥反應(yīng)過程中主要的致病成分[5]。脂多糖是由一個(gè)具有疏水性表面的錨Lipid A,一個(gè)核內(nèi)寡糖,以及一個(gè)復(fù)合-O-抗原多糖組成的[6]。內(nèi)毒素感染可導(dǎo)致炎癥發(fā)生,從而引起嘔吐,發(fā)熱,腹瀉,白細(xì)胞數(shù)目減少,及高血壓等癥狀。
在本研究中,通過觀察黃連提取物對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素導(dǎo)致的家兔發(fā)熱及小鼠死亡的影響,探討其抗細(xì)菌內(nèi)毒素作用,為研究黃連提取物在抗菌機(jī)制方面的探索提供實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。
1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1 藥物 黃連提取物(鹽酸小檗堿含量85%),由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供,批號(hào):1100315。
1.2 動(dòng)物 Balb/C小鼠、大耳白家兔,沈陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室提供。合格證號(hào):遼實(shí)動(dòng)質(zhì)字[2010]022號(hào)。
1.3 細(xì)菌內(nèi)毒素 細(xì)菌內(nèi)毒素,中國藥品生物制品檢定所出品。效價(jià):9000EU/amp。
1.4 實(shí)驗(yàn)條件 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠飼養(yǎng),喂顆粒飼料,自由飲水,室溫(20±2)℃,濕度55%~60%。
1.5 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用t檢驗(yàn)。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 內(nèi)毒素導(dǎo)致家兔發(fā)熱模型的建立及黃連提取物的治療[7] 取健康無病大耳白家兔,體重1.5 kg~2.5kg,每日測(cè)量體溫2次,連續(xù)測(cè)量3日,選擇體溫范圍在38.6℃~39.5℃,體溫波動(dòng)范圍在0.3℃以內(nèi)的家兔。隨機(jī)分為4組,每組6只。第一組為空白對(duì)照組、第二、三、四組分別為黃連提取物0.10g/kg、0.08g/kg、0.06g/kg三個(gè)劑量組。試驗(yàn)前分別測(cè)量肛溫兩次,間隔1小時(shí),取平均值作為基礎(chǔ)體溫。各組動(dòng)物分別按2.5ml/kg灌胃給藥,空白組灌胃等容量的蒸餾水。給藥后1小時(shí),耳緣靜脈注射1EU/ml的細(xì)菌內(nèi)毒素0.8ml/kg,于注射后1、2、3、4、5小時(shí)各測(cè)體溫1次。計(jì)算體溫變化(致熱后體溫與基礎(chǔ)體溫之差△T℃)。
2.2 死亡保護(hù)實(shí)驗(yàn)
2.2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)小鼠致死劑量預(yù)試取健康小鼠24只,體重18g~22g,雌雄各半,隨機(jī)分成4組,禁食不禁水12小時(shí)。取細(xì)菌內(nèi)毒素按使用說明書方法用注射用生理鹽水溶解至lml,超聲15分鐘,得9000EU/ml內(nèi)毒素溶液,再分別稀釋成9EU/ml、4EU/ml、2EU/ml、1EU/ml的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液。各組小鼠分別腹腔注射不同濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素0.5ml/只,觀察72小時(shí),記錄小鼠的死亡數(shù)及死亡時(shí)間。
2.2.2 內(nèi)毒素小鼠感染模型的建立及黃連提取物的治療 取小鼠50只,隨機(jī)分成4組,每組10只,雌雄各半,第一組為空白組、第二、三、四組為鹽酸小檗堿0.30g/kg、0.24g/kg、0.19g/kg三個(gè)劑量組。各組小鼠每日灌胃給藥一次,連續(xù)給藥3日,于第一次給藥后1h,每只小鼠分別腹腔注射2EU/ml細(xì)菌內(nèi)毒素0.5ml/只,觀察72小時(shí),記錄小鼠死亡數(shù)及死亡時(shí)間,結(jié)果見表3。
3 結(jié)果
3.1 黃連提取物對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)發(fā)熱家兔的解熱作用 黃連提取物三個(gè)劑量組(0.10g/kg、0.08g/kg、0.06g/kg)給藥后1、2、3、5小時(shí),體溫都要顯著低于空白組。詳細(xì)的溫度數(shù)據(jù)見表1。
3.2 黃連提取物對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素所致小鼠死亡的保護(hù)作用 細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)小鼠致死劑量預(yù)試結(jié)果顯示2EU/ml的內(nèi)毒素溶液給小鼠腹腔注射0.5ml/只,其致死率在80%以上,結(jié)果見表2。黃連提取物三個(gè)劑量組(0.30g/kg、0.24g/kg、0.19g/kg)小鼠的死亡率分別為30%,50%,50%.都明顯低于空白組的80%(表3),三個(gè)劑量組的小鼠平均死亡時(shí)間分別為14.67h,13.89h,12.16h,較空白組的5.51h明顯延長(圖1)。以0.30g/kg組的作用效果較為明顯(P<0.05)。
4 討論
本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,三個(gè)劑量組(0.10g/kg、0.08g/kg、0.06g/kg)的黃連提取物在給藥后1、2、3、4、5小時(shí),對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素所致的家兔發(fā)熱都有較明顯的解熱作用,尤以0.08g/kg 劑量組作用最為明顯;三個(gè)不同劑量的黃連提取物(0.30g/kg、0.24g/kg、0.19g/kg)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素所致小鼠死亡有一定保護(hù)作用,并可延長內(nèi)毒素對(duì)小鼠的致死時(shí)間,以0.30g/kg組的作用效果較為明顯。
內(nèi)毒素能作用于巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞,通過結(jié)合TLR4受體而被機(jī)體識(shí)別,從而引起先天免疫反應(yīng),產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有致熱性的細(xì)胞因子有白細(xì)胞介素-1 、白細(xì)胞致熱源、腫瘤壞死因子、干擾素、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1和睫狀體促神經(jīng)因子等[8-10]。LPS 是目前已知的誘導(dǎo)IL-1和TNF 最重要的因子。研究發(fā)現(xiàn),濃度為25 ng/L~50 ng/L的LPS 可以使新鮮人血中的單核細(xì)胞生成IL-1 和TNF[11]。這些細(xì)胞因子作用于宿主下丘腦的體溫調(diào)節(jié)中樞,促使體溫升高發(fā)熱。內(nèi)毒素引發(fā)炎癥反應(yīng)不僅會(huì)使機(jī)體發(fā)熱,并且也會(huì)導(dǎo)致腹瀉,甚至引發(fā)死亡。黃連提取物可能是通過阻斷了內(nèi)毒素引發(fā)炎癥的信號(hào)通路,從而呈現(xiàn)出解熱,死亡保護(hù)的作用。
近年來,人們?cè)O(shè)計(jì)合成出多種抗內(nèi)毒素感染的藥物。而作為一種傳統(tǒng)的祖國醫(yī)藥,黃連具有見效快,副作用小,且成本低等特點(diǎn).所以黃連可以取代昂貴或副作用大的藥物,廣泛的應(yīng)用于臨床治療中。且近年抗生素濫用的現(xiàn)象極其嚴(yán)重,一些細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生了耐藥現(xiàn)象。黃連提取出的生物堿與抗生素聯(lián)合使用抗菌不僅可以提高抗生素抗菌活性,且可以減少抗生素的濫用?;诖耍S連在抗菌方面具有很大的應(yīng)用前景,進(jìn)一步深入研究黃連提取物抗菌機(jī)制意義重大。
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