劉麗麗，李 爽，李海東，宋卓敏

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，天津 300070；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300193）

1 材料與方法

1.2 含藥血清制備 選SD大鼠，體質(zhì)量（375±25）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)前，置動(dòng)物于室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境，常規(guī)喂養(yǎng)1周。將體質(zhì)量≥400g或者≤350g的SD大鼠予以剔除。共體質(zhì)量相近的SD大鼠50只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：正常對(duì)照組、中藥高、中、低劑量組，每組10只。正常對(duì)照組：給予蒸餾水。中藥高、中、低劑量組：用藥劑量為根據(jù)人的日用藥量，按大鼠體表面積比率換算成等效劑量的2、1、0.5倍，具體數(shù)據(jù)分別為4、2、1g/kg干粉（相當(dāng)于18、9、4.5g/kg生藥）。每次1mL/100g體質(zhì)量，每天2次，間隔10h，連續(xù)灌胃5d，第5天上午灌服藥物后1h腹主動(dòng)脈取血，離心處理后，取血清2mL左右，置于無(wú)菌試管中，56℃水浴滅活30min，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，密封，-20℃冰箱中凍存。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 17β-雌二醇（美國(guó)Sigma公司）；ICI-182780（美國(guó)Sigma公司）。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（EA.hy926）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，體外培養(yǎng)傳代；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO）；優(yōu)質(zhì)小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；MTT粉（北京天港邦定生物醫(yī)學(xué)科技有限公司）；二甲基亞砜（上海菲達(dá)有限公司）；青、鏈霉素（華北制藥股份有限公司）；流式細(xì)胞儀（FCM，Becton-dickinson公司）。

1.4 研究方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（EA.hy926），接種于含10％小牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)，至EA.hy926細(xì)胞生長(zhǎng)成單層后備用。

1.4.2 細(xì)胞分組及干預(yù) 培養(yǎng)的EA.hy926細(xì)胞，隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照血清組；17 β-Estradiol組（簡(jiǎn)稱E2組）；E2加ICI 182，780組（簡(jiǎn)稱E2加ICI組）；E2加中藥高劑量含藥血清組；E2加中藥中劑量含藥血清組；E2加中藥低劑量含藥血清組。用DMEM培養(yǎng)液配成終濃度為15％的含藥血清或?qū)φ昭?，E2終濃度10-8mol/L，ICI終濃度10-7mol/L。

1.4.3 MTT法檢測(cè)EA.hy926細(xì)胞增殖 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA.hy926細(xì)胞，胰酶消化后細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5×105個(gè)/L濃度接種于96孔培養(yǎng)板，200μL每孔，常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞貼附，孵育24h后，棄原培養(yǎng)液，換新鮮培養(yǎng)液，180μL每孔。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)將不同濃度的含藥血清及試劑以每孔20μL量加入。繼續(xù)孵育48h后，每孔加入MTT 20μL，繼續(xù)孵育4h。傾去藥液及培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150μL，振蕩10min，37℃繼續(xù)孵育，直至鏡下觀察二甲基亞砜全部溶解后，以自動(dòng)酶標(biāo)儀，490nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值（A值），每組6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取其平均值。

1.4.4 劃痕法檢查EA.hy926的遷移能力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA.hy926細(xì)胞，胰酶消化后細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5×105個(gè)/L濃度接種于6孔培養(yǎng)板。常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞貼附，孵育24h后，棄去培養(yǎng)基，用無(wú)血清培養(yǎng)基漂洗1次，此時(shí)用無(wú)菌的槍頭（tips）沿各孔中軸均勻劃一道裸露的無(wú)細(xì)胞帶，用PBS漂洗劃下的細(xì)胞2～3次。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)加入無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液配制的不同濃度的含藥血清及試劑，每組均設(shè)6個(gè)平行孔，以這一時(shí)間點(diǎn)作為零時(shí)間點(diǎn)，后置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48h，分別在0、48h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在倒置顯微鏡下觀察同一位置的細(xì)胞遷移情況，拍照記錄。每孔隨即選擇測(cè)3個(gè)視野，取平均值計(jì)算細(xì)胞遷移數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.4.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EA.hy926細(xì)胞凋亡率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA.hy926細(xì)胞，胰酶消化后細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5×105個(gè)/L濃度接種于6孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞貼附，孵育24h后，棄原培養(yǎng)液，換新鮮培養(yǎng)液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)加入不同濃度的含藥血清及試劑。繼續(xù)孵育48h后，胰酶消化（無(wú)EDTA），迅速加入收集的培養(yǎng)液終止消化反應(yīng)。1 500r/min離心5min，棄上清，收集細(xì)胞于10mL離心管中。4℃預(yù)冷的PBS洗2次。用PBS結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為106細(xì)胞/mL。取200μL細(xì)胞懸液于5mL流式管中，加入5μL Annexin V-FITC（150mg/L）和5μL碘化丙錠（PI，120mg/L），混勻后室溫避光孵育15min，在反應(yīng)管中加500μL PBS，流式細(xì)胞儀分析。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較應(yīng)用One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 各組EA.hy926細(xì)胞增殖、遷移數(shù)、細(xì)胞凋亡的比較（±s，n=18）

表1 各組EA.hy926細(xì)胞增殖、遷移數(shù)、細(xì)胞凋亡的比較（±s，n=18）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與E2組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與E2加中藥高劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組 別 細(xì)胞增殖 細(xì)胞遷移數(shù)/個(gè) 細(xì)胞凋亡率/％正常對(duì)照血清組 0.433±0.044△△▲ 170.39±10.56△△▲▲ 8.021±0.641△△▲▲E2組 0.602±0.027##▲▲ 214.56±14.78##▲▲ 5.418±0.873##▲▲E2加ICI組 0.447±0.017△△▲▲ 174.39±10.98△△▲▲ 7.643±1.020△△▲E2加中藥高劑量含藥血清組 0.478±0.015△## 187.94±9.43##△△ 6.514±0.580##△△E2加中藥中劑量含藥血清組 0.521±0.022##△△▲▲ 199.39±14.59##△△▲ 5.333±0.950##▲▲E2加中藥低劑量含藥血清組 0.587±0.223##▲▲ 209.33±26.51##▲▲ 5.457±0.676##▲▲

如表1所示：正常組EA.hy926細(xì)胞的增殖低于E2組、E2加中藥中、低劑量組（P＜0.01）、E2加中藥高劑量組（P＜0.05），與E2加ICI組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；E2組高于除E2加中藥低劑量組外的其它各組（P＜0.01），與E2加中藥低劑量組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；E2加中藥高劑量組EA.hy926細(xì)胞的增殖顯著低于E2加中藥中、低劑量組（P＜0.01），高于E2加ICI組（P＜0.01），E2加中藥中劑量組顯著低于E2加中藥低劑量組（P＜0.01）。

正常組EA.hy926細(xì)胞遷移數(shù)顯著低于E2組、E2加中藥高、中、低劑量組（P＜0.01），與E2加ICI組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；E2組高于除E2加中藥低劑量組外的其它各組（P＜0.01），與E2加中藥低劑量組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；E2加中藥高劑量組低于E2加中藥中劑量組（P＜0.05）及E2加中藥低劑量組（P＜0.01），顯著高于E2加ICI組（P＜0.01），E2加中藥中劑量組低于E2加中藥低劑量組（P＜0.05）。

正常組EA.hy926細(xì)胞凋亡率顯著高于E2組、E2加中藥高、中、低劑量組（P＜0.01），與E2加ICI組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05），E2組顯著低于除E2加中藥中、低劑量組外的其它各組（P＜0.01），與E2加中藥中、低劑量組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；E2加中藥高劑量組EA.hy926細(xì)胞凋亡率顯著高于E2加中藥中、低劑量組（P＜0.01），低于E2加ICI組（P＜0.05）；E2加中藥中劑量組與E2加中藥低劑量組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)E2處理的EA.hy926細(xì)胞，其增值、遷移明顯高于正常組，細(xì)胞凋亡率明顯低于正常組；而ICI和益氣消法中藥均可明顯阻斷E2對(duì)EA.hy926的細(xì)胞的增值、遷移的促進(jìn)作用，阻斷E2對(duì)EA.hy926細(xì)胞的凋亡的抑制作用，與E2組比較有顯著差異（P＜0.01）。據(jù)現(xiàn)代藥理研究該方中多味中藥有抗腫瘤血管生成作用。黨參提取物對(duì)紫杉醇抑制血管生成和移植腫瘤轉(zhuǎn)移有一定的增強(qiáng)作用［2］。莪術(shù)油注射液對(duì)小鼠移植性S180肉瘤血管形成有抑制作用［3］。續(xù)斷有抑制子宮收縮、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、改善局部血循環(huán)、促進(jìn)血腫的吸收機(jī)化、抗感染等藥理作用［4］。鱉甲有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗腫瘤、抗突變、抗纖維化等藥理作用［5］。白芥子有抗腫瘤、抗雄激素、抑菌等藥理作用［6］。郁金及其提取物有保護(hù)染色體突變的作用，對(duì)癌細(xì)胞有明顯的抑制作用［7］。此為益氣消法中藥干擾血管生成過(guò)程，抑制血管新生，從而抑制子宮肌瘤血管生長(zhǎng)、肌瘤發(fā)展的原因之一。但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

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