劉延濱 王承義

（黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，黑龍江哈爾濱150081）

菌根這一現(xiàn)象在自然界中廣泛存在，保守估計(jì)大約90%以上的陸生植物具有菌根，它是植物和土壤之間能量和物質(zhì)交換的通道。植物為菌根菌提供其生長發(fā)育所需的糖類物質(zhì)（主要是植物光和同化產(chǎn)物）；菌根菌可以為植物提供水分，特別是在水分虧缺的情況下菌根菌可以為植物提供更多的水分輸送；菌根菌菌絲可以分泌大量的幾丁質(zhì)酶、磷酸酶和蛋白酶等分解酶，可以直接分解有機(jī)質(zhì)為植物提供N和P，也可以分解土壤中的難溶物質(zhì)，甚至巖石，為植物提供各種無機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)，包括N、P、K及微量元素等。因而其所發(fā)揮的功能對于整個(gè)陸地生態(tài)系統(tǒng)至關(guān)重要，目前已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。

外生菌根菌在營養(yǎng)相對缺乏的森林生態(tài)系統(tǒng)中占絕對優(yōu)勢，有許多文獻(xiàn)揭示出外生菌根菌可提高寄主植物無機(jī)養(yǎng)分的吸收。Mahmood等［1］測試了38種外生菌根，發(fā)現(xiàn)有些外生菌根菌的菌絲分泌草酸形成草酸鈣的晶體，P轉(zhuǎn)化成可溶性的化合物而被吸收，有學(xué)者認(rèn)為這是外生菌根菌捕獲P的一種方式［2］。van Schll等［3］發(fā)現(xiàn)外生菌根菌菌絲可以分泌低分子有機(jī)陰離子侵蝕巖石，使云母、蛭石、硅酸鹽礦石等富K礦石釋放出K，侵蝕角閃石釋放出Mg。一般情況下，溫帶森林生態(tài)系統(tǒng)中土壤有機(jī)質(zhì)養(yǎng)分占土壤養(yǎng)分的絕大部分，如植物枯枝落葉、動(dòng)物殘?bào)w等。有研究顯示新鮮的森林腐殖質(zhì)和死亡的苔蘚可以促進(jìn)外生菌根菌菌絲的增殖。Bending和Read［4］研究了外生菌根菌Suillus bovinus（Fr．）O．Kuntze和Thelephora terrestris（Ehrh．）與Pinus sylvestris L．形成外生菌根后的養(yǎng)分捕獲行為，通過檢驗(yàn)有機(jī)養(yǎng)分斑塊（取自發(fā)酵層有機(jī)質(zhì)（fermentation horizon organic matter，F(xiàn)HOM））中營養(yǎng)成分的減少程度來度量不同外生菌根菌的塑性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者使N、P和K濃度分別減少23%、22%和30%，后者使N和K的濃度分別減少13%和21%。

樟子松（Pinus sylvestris var．mongolica），又名海拉爾松、蒙古赤松，屬松杉綱松科松屬，是歐洲赤松分布至遠(yuǎn)東的一個(gè)地理變種。它對土壤的要求不嚴(yán)，在干燥瘠薄、巖石裸露、沙地、陡坡，其他樹種不能生長的地方均可生長良好。因此樟子松已經(jīng)成為適于干旱半干旱地區(qū)沙地抗旱造林的主要樹種之一。然而，由于樟子松外生菌根研究的嚴(yán)重缺失，未開展菌根化育苗造成苗木質(zhì)量差、造林成活率低。由于干旱半干旱地區(qū)的氣候、土壤等客觀因素的影響，必須以適地適樹為基礎(chǔ)，配合以適當(dāng)?shù)纳锛夹g(shù)進(jìn)行抗旱造林。大量研究表明，菌根化育苗可提高造林成活率，促進(jìn)苗木生長，確保該地區(qū)造林成功［5］。

因此，篩選出合適的樟子松外生菌根菌培養(yǎng)條件是實(shí)現(xiàn)樟子松菌根化育苗的基礎(chǔ)，本研究的目的就是通過篩選合適的培養(yǎng)基和合適的培養(yǎng)條件來使其生長迅速，為下一步的接種和大量菌種的擴(kuò)繁提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種使用在豐林自然保護(hù)區(qū)分離培養(yǎng)的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌（Suillus granulatus（L．：Fr．）O．Kuntce）菌株。培養(yǎng)基使用MMN和綜合PDA培養(yǎng)基（表1），在培養(yǎng)基中加入20%樟子松葉的浸提液。

表1 培養(yǎng)基配方

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1．2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)室對外生菌根進(jìn)行純培養(yǎng)，所有實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)箱中進(jìn)行。對分離的菌株分別使用MMN和綜合PDA培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入樟子松葉的浸提液。培養(yǎng)基類型，是否添加樟子松葉的浸提物共計(jì)4個(gè)水平處理，每個(gè)處理設(shè)置10個(gè)重復(fù)，共計(jì)40個(gè)實(shí)驗(yàn)單位。每隔2天測定菌落的直徑作為生長狀況的測定標(biāo)準(zhǔn)。通過培養(yǎng)基的篩選確定較優(yōu)的培養(yǎng)基配方進(jìn)行培養(yǎng)條件實(shí)驗(yàn)，pH值設(shè)置為6．5、7．0和7．5三個(gè)水平，溫度設(shè)置15℃和25℃兩個(gè)水平，每個(gè)水平設(shè)置10個(gè)重復(fù)，共計(jì)50個(gè)實(shí)驗(yàn)單位（不考慮交互作用），同樣測定菌落直徑。

1．3 數(shù)據(jù)處理

使用spss 19．0的one－way ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同培養(yǎng)基對點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌株純培養(yǎng)的影響

點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌在綜合PDA培養(yǎng)基上菌絲的生長速度較在MMN培養(yǎng)基上快（圖1）；綜合PDA培養(yǎng)基中加入樟子松松針浸提液明顯能促進(jìn)菌絲的生長，而樟子松松針浸提液對于MMN上的菌絲生長影響不明顯（表2）。

表2 不同培養(yǎng)基對菌株的生長方差分析檢驗(yàn)

2．2 pH值對點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌株純培養(yǎng)的影響

pH值是真菌菌絲生長的重要條件之一，因?yàn)橥馍L期生長在不同的土壤中，土壤的pH值差異是很大的，比如北方的森林暗棕壤微偏酸性，鹽堿地的土壤偏堿性，外生菌根菌長期同植物進(jìn)化過程中也是同不同的土壤環(huán)境相適應(yīng)的。本研究主要是針對點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌設(shè)置了3個(gè)不同的pH值，觀察其在不同pH值下的生長狀況，結(jié)果顯示pH值為6．5時(shí)，菌絲在綜合PDA培養(yǎng)基上的生長速度顯著快于pH值為7和7．5的培養(yǎng)基（圖2，表3）。因此，pH值為6．5綜合PDA培養(yǎng)基適合點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌的生長。

表3 不同pH值對菌株的生長方差分析檢驗(yàn)（P＜0．05）

2．3 溫度對點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌株純培養(yǎng)的影響

真菌的生長同溫度是密切相關(guān)的，一般情況下存在真菌生長的適宜溫度范圍，有些真菌是低溫型的，而有些可能是高溫型的。本研究采集的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌是在伊春的豐林自然保護(hù)區(qū)，夏季溫度較低，推斷可能在較低的溫度適合其生長。但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌純培養(yǎng)的適宜溫度是在25℃，方差分析顯示其菌絲在溫度控制在25℃時(shí)生長迅速，在15℃時(shí)生長緩慢，差異顯著（圖3，表4）。

表4 不同pH值對菌株的生長方差分析檢驗(yàn)（P＜0．05）

3 討論

培養(yǎng)基是外生菌根菌生長的基質(zhì)，不同的外生菌根菌對于C源和N源的需求是不同的。有研究發(fā)現(xiàn)，以麥芽浸膏為氮源時(shí)基生菌絲比較旺盛，氮源為蛋白胨時(shí)氣生菌絲比較旺盛，因此在配置培養(yǎng)基時(shí)，二者以適當(dāng)?shù)谋壤浜鲜褂脤⒏谕馍纳L。本研究中MMN培養(yǎng)基添加的是麥芽浸膏，而PDA培養(yǎng)基添加的是蛋白胨，結(jié)果表明點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌適合蛋白胨作為N源。添加樟子松松針浸提液對點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌生長的影響機(jī)制缺乏深入的研究，可能是某種物質(zhì)促發(fā)了菌絲的快速生長，但是MMN培養(yǎng)基中添加與否沒有顯著影響。

溫度是影響外生菌根菌生長發(fā)育的重要因素之一，不同外生菌根菌生長的最適溫度不盡相同。一般而言，多數(shù)菌根真菌適宜在20～28℃條件下生長，最高溫度極限為35℃，但少數(shù)菌種可達(dá)40℃［6］。畢國昌等［7］對云南省不同針葉林下常見外生菌根菌的44個(gè)菌株進(jìn)行純培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)菌株最適生長溫度為25℃，最高臨界生長溫度為40℃，少數(shù)菌株在5℃時(shí)也能緩慢生長，長期放在5℃低溫下的菌株即使已經(jīng)停止生長，一旦置于適溫條件下，均能很快恢復(fù)生長，生活力并不受影響。值得注意的是，同一菌株在人工純培養(yǎng)條件下與在自然條件下對溫度的要求不同。自然條件下，適宜生長溫度的范圍往往要寬一些，而且因?yàn)榫男纬墒苤T多條件影響，其中還包括溫度對宿主植物的影響，所以菌根真菌菌絲體生長的最適溫度不一定是形成菌根的最適溫度［6］。

一般來說，菌根真菌喜酸性，最適pH為4．0～6．0，但是少數(shù)菌根真菌喜弱堿性生長條件［8］。謝一青等［9］、趙志鵬等［10］研究表明，不同菌株的適宜pH不盡相同，彩色豆馬勃（Pisolithus tinctor ius）、紅絨蓋牛肝（Xerocomus chrysenteron）和灰蓋牛肝菌（Boletus griseus）較適宜在酸性條件下生長，厚環(huán)乳牛肝菌（Suillus grevillei）喜中性，小美牛肝菌（Boletus speciosus）則偏堿性，劣味乳菇（Lactarius insulsus）在堿性條件下生長較好，適宜于擴(kuò)大培養(yǎng)及推廣應(yīng)用的pH在7．0～8．0，但專一性不強(qiáng)，相互差別也較小。本研究中，點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌在微酸條件下生長較好。

試驗(yàn)初步確定了點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌的最適純培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)其最適生長條件為pH值6．5，溫度為25℃，加入樟子松松針浸提液的綜合PDA培養(yǎng)基。

［1］Mahmood，S．，F(xiàn)inlay R．D．，Erland，S．，Wallander，H．Solubilisation and colonisation of wood ash by ectomycorrhizal fungi isolated from a wood ash fertilised spruce forest［J］．FEMSMicrobiology Ecology，2001，35(2):151～161．

［2］Sayer J．A．a(chǎn)nd Gadd G．M．Solubilization and transformation of insoluble inorganic metal compounds to insoluble metal oxalates by Aspergillus niger［J］．Mycological Research 1997，(101):653～661．

［3］van Schll，L．，Kuyper，T．，Smits，M．，Landeweert，R．，Hoffland，E．，Breemen N．，Rock－eating mycorrhizas:their role in plant nutrition and biogeochemical cycles［J］．Plant and Soil，2008，303(1):35～47．

［4］Bending，G．D．a(chǎn)nd Read D．J．The structure and function of the vegetative mycelium of ectomycorrhizal plants V．Foraging behaviour and translocation of nutrients from exploited litter［J］．New Phytologist，1995，130(3):401～409．

［5］趙瓊，曾德慧，于占源，鄧斌，范志平．沙地樟子松人工林土壤磷素轉(zhuǎn)化的根際效應(yīng)［J］．應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，17（8）：1377～1381．

［6］蔣盛巖，張平，胡勁松，等．外生菌根菌白毒傘（Amanita verna）菌絲體純培養(yǎng)條件［J］．湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2002，25（1）：75～77．

［7］畢國昌，郭秀珍，臧穆．在純培養(yǎng)條件下溫度對外生菌根菌生長的影響［J］．林業(yè)科學(xué)研究，1989，2（3）：247～253．

［8］弓明欽，陳應(yīng)龍，仲崇祿，等．菌根研究及應(yīng)用［M］．北京：中國林業(yè)出版社，1997：37～46．

［9］謝一青，李志真，楊宗武．pH、鹽濃度及鋁離子對菌根菌生長的影響［J］．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，24（2）：204～207．

［10］趙志鵬，郭秀珍．外生菌根真菌純培養(yǎng)的生態(tài)學(xué)研究［J］．林業(yè)科學(xué)研究，1989，2（2）：136～141．