何啟剛，伍時華，趙東玲，易弋，黃翠姬，應(yīng)玲云，劉光鵬

(廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州，545006)

低等真菌可以通過改變細(xì)胞生理、形態(tài)和粘附性來應(yīng)對外界環(huán)境變化，營養(yǎng)貧乏時形成孢子，或通過二態(tài)性轉(zhuǎn)換機制進行絲狀生長，形成菌絲［1-2］。分枝菌絲在較小的生物量消耗下，擁有更強的營養(yǎng)探尋能力;菌絲較高的表面積體積比可能有利于營養(yǎng)運輸［3-4］。酵母菌的絲狀生長主要有假菌絲生長和侵入生長兩種，前者以長鏈或分支鏈狀細(xì)胞為特征［5］，后者在葡萄糖和其他發(fā)酵糖類不存在時，采用非軸向出芽和細(xì)胞形態(tài)延伸侵入瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)部［6］。

雖然工業(yè)釀酒酵母的二態(tài)性在100多年前就被觀察到，但因其非致病性和實驗室菌株多不具備絲狀生長能力［7-8］，釀酒酵母的二態(tài)性直到20年前才被重視［5］。影響及誘導(dǎo)釀酒酵母絲狀生長的因素較多，如醇類［9］、碳源［10］、氮源［11］、菌落密度［12］、錳離子［13］、微重力［14］等。在應(yīng)激條件下絲狀生長有利于釀酒酵母的存活［15］，Bramucci等通過增加絲狀生長反應(yīng)途徑轉(zhuǎn)錄因子MSS11p的表達，提高了酵母菌對丁醇的耐受能力［16］。

本文將釀酒酵母分別接種在氮源、碳源受限和醇類存在下的瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)，用顯微鏡觀察形態(tài)變化，研究其絲狀生長。

1 材料和方法

1.1 菌株

實驗所用菌株及其特性見表1。菌株保藏在4℃，每月用YPD培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接1次。

表1 研究所用的釀酒酵母菌株Table 1 Saccharomyces cerevisiae strains used in this work

1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L):酵母浸膏10，細(xì)菌學(xué)蛋白胨20，葡萄糖20，瓊脂粉20，pH 自然。

YEP培養(yǎng)基(g/L):酵母浸膏10，細(xì)菌學(xué)蛋白胨20，瓊脂粉20，pH自然。

氮源受限培養(yǎng)基為SLAD培養(yǎng)基［17］。

1.3 醇類誘導(dǎo)絲狀生長

將釀酒酵母分別接種在含有醇的YPD瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)2 d。本實驗所用醇類及其在培養(yǎng)基中的終濃度(v/v)為:甲醇 0.08%、0.32%、1.0%、2.0%;乙醇 1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%;丙醇和丁醇均為 0.75%、1.0%、1.5%、2.0%;戊醇、異丁醇和異戊醇均為0.08%、0.32%、0.5%、1.0%。YPD培養(yǎng)基經(jīng)7.5×104Pa高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻至50℃時加入醇類，將含有各種醇的平板培養(yǎng)基分別用保鮮袋密封。

1.4 氮源受限誘導(dǎo)絲狀生長

將釀酒酵母分別接種在SLAD瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)3 d。葡萄糖和瓊脂粉配成的培養(yǎng)基用7.5×104Pa高壓蒸汽滅菌30 min，其它成分用0.22 μm膜過濾除菌。

1.5 碳源受限誘導(dǎo)絲狀生長

將釀酒酵母接種在YEP瓊脂平板(以糖類作為碳源)上，28℃培養(yǎng)7 d。用蒸餾水將菌落洗去，若酵母侵入瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)部，會留下“斑點”。在“斑點”位置橫切培養(yǎng)基，用顯微鏡在100倍下拍攝橫切面和400倍下拍攝細(xì)胞形態(tài)。所用8種糖分別為:葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、殼聚糖、木糖和可溶性淀粉，在培養(yǎng)基中的終濃度為2%(w/v)。

1.6 細(xì)胞形態(tài)觀察

菌落細(xì)胞形態(tài)或培養(yǎng)基切片用Motic數(shù)碼生物顯微鏡(DMB5)觀察并拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 醇類誘導(dǎo)絲狀生長

為了研究醇類對4株釀酒酵母是否有絲狀生長誘導(dǎo)作用，將酵母分別接種在含有不同醇的YPD瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)2 d，用顯微鏡觀察菌落細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果表明，丙醇、丁醇和戊醇可誘導(dǎo)4株釀酒酵母進行絲狀生長，是良好的絲狀生長誘導(dǎo)物。菌株GJ2008和SC2012在醇類誘導(dǎo)下表現(xiàn)出明顯的絲狀生長特性(表2)。1.0%異戊醇可誘導(dǎo)GGFS16出現(xiàn)多細(xì)胞形態(tài)并有小的分枝，但菌絲形態(tài)并不突出(圖5)。

酵母細(xì)胞形態(tài)應(yīng)激反應(yīng)與菌株、醇種類及濃度密切相關(guān)，沒有菌株被所有的醇誘導(dǎo)形成菌絲，也沒有一種醇可以誘導(dǎo)所有的菌株形成菌絲［15］，本實驗室4株釀酒酵母也不能被實驗所用7種醇全部誘導(dǎo)形成菌絲，但均有菌絲形成能力，可被丙醇、丁醇和戊醇誘導(dǎo)形成菌絲(表2)。

Lorenz等報道，幾種氨基酸代謝產(chǎn)生的醇類(包括甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、戊醇、異戊醇等)，尤其是丁醇和異戊醇可顯著誘導(dǎo)單倍體釀酒酵母進行絲狀生長［9］。乙醇、丙醇、丁醇、異丁醇、戊醇、異戊醇對本實驗室4株釀酒酵母的個別或全部菌株有絲狀生長誘導(dǎo)能力，甲醇在0.8%-2.0%范圍內(nèi)沒有誘導(dǎo)4株釀酒酵母產(chǎn)生菌絲(表2)，這和Silva等［15］實驗結(jié)果一致，但甲醇在1.0%時，菌株GJ2008出現(xiàn)了細(xì)胞延伸和多細(xì)胞形態(tài)(圖5)，這可能是菌株不同所致。

表2 醇類對釀酒酵母絲狀生長的影響Table 2 Effect of alcohols on filamentation in Saccharomyces cerevisiae

在單倍體菌株SC2012和SS2012中，絲狀生長以細(xì)胞形態(tài)延伸和細(xì)胞凝聚為特性(圖3和圖4)，其中，SC2012在丙醇、異丁醇和異戊醇存在下最為突出(圖3)。在雙倍體菌株GGFS16和GJ2008中，絲狀生長以細(xì)胞延伸為主(圖1和圖2)。

圖1 GGFS16在YPD平板上28℃培養(yǎng)2 d的細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology of GGFS16 cultivated on YPD plates for 2 days at 28℃

2.2 氮源受限誘導(dǎo)絲狀生長

為了研究氮源受限對本實驗室4株釀酒酵母是否有絲狀生長誘導(dǎo)作用，將4株酵母接種在SLAD瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)3 d。用顯微鏡觀察菌落細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn):除細(xì)胞瘦小之外，并未出現(xiàn)絲狀生長，這和Silva等［15］實驗結(jié)果一致。但Gimeno等實驗結(jié)果表明，氮源受限培養(yǎng)基可誘導(dǎo)菌絲形成［5］，可能是菌株不同所致。Gimeno等實驗所用菌株均以釀酒酵母∑1278b為遺傳背景，擁有假菌絲形成能力［5］，而Silva和本實驗所用菌株多為工業(yè)菌株［15］。

圖2 GJ2008在YPD平板上28℃培養(yǎng)2 d的細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Cell morphology of GJ2008 cultivated on YPD plates for 2 days at 28℃

圖3 SC2012在YPD平板上28℃培養(yǎng)2 d的細(xì)胞形態(tài)Fig.3 Cell morphology of SC2012 cultivated on YPD plates for 2 days at 28℃

圖4 SS2012在YPD平板上28℃培養(yǎng)2 d的細(xì)胞形態(tài)Fig.4 Cell morphology of SS2012 cultivated on YPD plates for 2 days at 28℃

圖5 異戊醇和甲醇誘導(dǎo)菌株的細(xì)胞形態(tài)Fig.5 Cell morphology of strains induced by isoamyl alcohol and methanol

2.3 碳源受限誘導(dǎo)絲狀生長

為了研究碳源對酵母侵入生長及菌落細(xì)胞形態(tài)的影響，將4株釀酒酵母接種在YEP瓊脂平板(分別以8種糖作為碳源)上，28℃培養(yǎng)7 d。結(jié)果表明，單倍體菌株SS2012在果糖、麥芽糖、乳糖作為碳源時，出現(xiàn)侵入生長，雙倍體菌株GJ2008在果糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉作為碳源時，也出現(xiàn)侵入生長(圖6);而雙倍體GGFS16和單倍體SC2012菌株并未在以上8種糖作為碳源的培養(yǎng)基內(nèi)部出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)變化(表3)。

用顯微鏡觀察菌落細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn):GJ2008在乳糖、殼聚糖和可溶性淀粉作為碳源時，沒有出現(xiàn)絲狀生長，但產(chǎn)生孢子;GJ2008在麥芽糖、木糖作為碳源，SC2012在葡萄糖、蔗糖作為碳源時，出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)延伸并有小的分枝，但菌絲形態(tài)并不突出(圖7);GGFS16和SS2012在以上8種糖作為碳源時并未出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)變化。

碳源受限可以誘導(dǎo)單倍體酵母細(xì)胞形態(tài)延伸并穿透瓊脂培養(yǎng)基表面，侵入培養(yǎng)基內(nèi)部尋找營養(yǎng)，在細(xì)胞侵入培養(yǎng)基過程中會留下可見“斑點”［6］。單倍體SS2012出現(xiàn)侵入生長(圖6，5-7)，而單倍體SC2012并沒出現(xiàn)，可能是菌株不同所致。

侵入生長可能是二倍體工業(yè)釀酒酵母對碳源受限的應(yīng)激反應(yīng)，這可能與野生酵母在自然條件下的生長方式有關(guān)，有助于穿透自然底物尋求營養(yǎng)，如葡萄［18］、甘蔗［15］等。雙倍體 GJ2008 表現(xiàn)出侵入生長特性(圖6，1-4)，而雙倍體GGFS16沒有出現(xiàn)，這可能是菌株不同所致。

表3 碳源受限對釀酒酵母侵入生長的影響Table 3 Effect of carbon limitation on invasive growth in Saccharomyces cerevisiae

圖6 碳源受限誘導(dǎo)釀酒酵母侵入生長Fig.6 Invasive growth induced by carbon limitation in Saccharomyces cerevisiae

Casalone等［19］分離并觀察了約1 000種野生釀酒酵母的菌落和細(xì)胞形態(tài)，數(shù)據(jù)顯示在野生釀酒酵母中二態(tài)性普遍存在，但在二態(tài)性開關(guān)轉(zhuǎn)換方面有較大差異。這些酵母在不同應(yīng)激條件下，菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)和侵入狀況差別較大［19］。同樣，工業(yè)釀酒酵母的二態(tài)性也廣泛存在［20］，本實驗室4株釀酒酵母也均有二態(tài)性。

釀酒酵母的絲狀生長對酒精發(fā)酵的作用并不十分清楚，各研究者觀點有所不同。Silva等［15］報道，絲狀生長有利于酵母菌的存活，但對酒精生產(chǎn)沒有直接的影響。Ceccato-Antonini等［20］在接種和發(fā)酵前期誘導(dǎo)絲狀生長，發(fā)酵效率降低，這是由于菌絲形成泡沫阻止氣體從發(fā)酵液中釋放。Bramucci等［16］通過增加絲狀生長反應(yīng)途徑轉(zhuǎn)錄因子MSS11p的表達，提高了酵母菌對丁醇的耐受能力。釀酒酵母在發(fā)酵過程中的絲狀生長，可能是對其生長環(huán)境的適應(yīng)。

圖7 碳源受限誘導(dǎo)菌株的細(xì)胞形態(tài)Fig.7 Cell morphology of strains induced by carbon limitation

3 結(jié)論與展望

工業(yè)釀酒酵母GGFS16、GJ2008和相應(yīng)的單倍體SC2012和SS2012均可被丙醇、丁醇和戊醇誘導(dǎo)進行絲狀生長，醇類誘導(dǎo)絲狀生長在本實驗室單雙倍體釀酒酵母中普遍存在，但在氮源受限培養(yǎng)基上沒有出現(xiàn)絲狀生長。雙倍體GJ2008和單倍體SS2012在碳源受限培養(yǎng)基上，出現(xiàn)侵入生長，但雙倍體GGFS16和單倍體SC2012沒有出現(xiàn)侵入生長，侵入生長的存在與否與菌株有關(guān)。

釀酒酵母的絲狀生長有利于其應(yīng)對不利的生長環(huán)境，該觀點已被普遍接受。釀酒酵母的絲狀生長在發(fā)酵過程中的作用還不清楚，有待進一步研究。

［1］ Kron SJ，Gow NA.Budding yeast morphogenesis:signalling，cytoskeleton［J］.Current Opinion in Cell Biology，1995，7(6):845-855.

［2］ Gancedo JM.Control of pseudohyphae formation in Saccharomyces cerevisiae［J］.FEMS Microbiology Reviews，2001，25(1):107-123.

［3］ Palecek SP，Parikh AS，Kron SJ.Sensing，signalling and integrating physical processes during Saccharomyces cerevisiae invasive and filamentous growth［J］.Microbiology，2002，148(4):893-907.

［4］ Ceccato-Antonini SR，Sudbery PE.Filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae［J］.Brazilian Journal of Microbiology，2004，35(3):173-181.

［5］ Gimeno CJ，Ljungdahl PO，Styles CA，et al.Unipolar cell divisions in the yeast S.cerevisiae lead to filamentous growth:regulation by starvation and RAS［J］.Cell，1992，68(6):1 077-1 090.

［6］ Cullen PJ，Sprague GF.Glucose depletion causes haploid invasive growth in yeast［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2000，97(25):13 619-13 624.

［7］ Liu H，Styles CA，F(xiàn)ink GR.Saccharomyces cerevisiae S288C has a mutation in FLO8，a gene required for filamentous growth［J］.Genetics，1996，144(3):967-978.

［8］ Kron SJ.Filamentous growth in budding yeast［J］.Trends in Microbiology，1997，5(11):450-454.

［9］ Lorenz MC，Cutler NS，Heitman J.Characterization of alcohol-induced filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae［J］.Molecular Biology of the Cell，2000，11(1):183-199.

［10］ Granek JA，Magwene PM.Environmental and genetic determinants of colony morphology in yeast［J］.PLoS Genetics，2010，6(1):e1000823.

［11］ Song Q，Kumar A.An overview of autophagy and yeast pseudohyphal growth:integration of signaling pathways during nitrogen stress［J］.Cells，2012，1(3):263-283.

［12］ Lucaccioni A，Morpurgo G，Achilli A，et al.Colony density influences invasive and filamentous growth in Saccha-romyces cerevisiae［J］.Folia Microbiol(Praha)，2007，52(1):35-38.

［13］ Asleson CM，Asleson JC，Malandra E，et al.Filamentous growth of Saccharomyces cerevisiae is regulated by manganese［J］.Fungal Genetics and Biology，2000，30(2):155-162.

［14］ Van Mulders SE，Stassen C，Daenen L，et al.The influence of microgravity on invasive growth in Saccharomyces cerevisiae［J］.Astrobiology，2011，11(1):45-55.

［15］ Silva PC，Horii J，Miranda VS，et al.Characterization of industrial strains of Saccharomyces cerevisiae exhibiting filamentous growth induced by alcohols and nutrient deprivation［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2007，23(5):697-704.

［16］ Bramucci MG，Larossa RA，Singh M.Yeast with increased butanol tolerance involving filamentous growth response［P］.US:20100167363A1.2010-7-1.

［17］ Maneesri J，Azuma M，Torii S，et al.Characterization of a Saccharomyces cerevisiae mutant with pseudohyphae and cloning of a gene complementing the mutation［J］.Bioscience，Biotechnolgy，and Biochemistry，2003，67(3):517-524.

［18］ Gognies S，Barka EA，Gainvors-Claisse A，et al.Interactionsbetween yeasts and grapevines:filamentous growth，endopolygalacturonase and phytopathogenicity of colonizing yeasts［J］.Microbial Ecology，2006，51(1):109-116.

［19］ Casalone E，Barberio C，Cappellini L，et al.Characterization of Saccharomyces cerevisiae natural populations for pseudohyphal growth and colony morphology［J］.Research in Microbiology，2005，156(2):191-200.

［20］ Ceccato-Antonini SR.Biotechnological implications of filamentation in Saccharomyces cerevisiae［J］.Biotechnol Lett，2008，30(7):1 151-1 161.