高獻(xiàn)禮，孫鵬飛，閆爽，陳燕斌，陸健

1(江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

2(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，2141222)3(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫，214122)

中國(guó)產(chǎn)業(yè)信息網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示(http://data.chyxx.com/shpyl/201103/K79165 A8GP.html)，2011年我國(guó)醬油產(chǎn)量達(dá)662萬(wàn)t，總產(chǎn)量已經(jīng)超過(guò)我國(guó)調(diào)味品總產(chǎn)量的50%，是我國(guó)調(diào)味品和食品工業(yè)的重要組成部分。近十年來(lái)我國(guó)醬油行業(yè)在生產(chǎn)技術(shù)、設(shè)備和科學(xué)研究等方面取得了一定的進(jìn)步，使我國(guó)醬油的風(fēng)味、企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和形象不斷改善。但隨著我國(guó)人民生活水平的不斷提高和國(guó)外(主要是日本、韓國(guó))高檔次醬油進(jìn)入國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的影響，消費(fèi)者不但要求醬油具有良好的調(diào)味、去腥和上色功能，而且對(duì)醬油的外觀質(zhì)量要求也越來(lái)越高(如是否有沉淀、長(zhǎng)霉等)。近年來(lái)消費(fèi)者對(duì)國(guó)產(chǎn)醬油投訴最多，也是我國(guó)醬油行業(yè)普遍存在的質(zhì)量問題，即為醬油在儲(chǔ)存和銷售過(guò)程中的沉淀(醬油腳或二次沉淀)問題，其嚴(yán)重影響了產(chǎn)品的外觀穩(wěn)定性、消費(fèi)者的購(gòu)買欲和企業(yè)的形象，導(dǎo)致企業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力下降［1-4］。

醬油二次沉淀樣品的制備是研究其化學(xué)組成、分子結(jié)構(gòu)特征及在儲(chǔ)藏和運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)生沉淀機(jī)理的先決條件。因此，醬油二次沉淀樣品的制備方法對(duì)研究和最終解決醬油二次沉淀問題尤為重要。張志航等［5］采用樣品靜置、虹吸和透析法制備了醬油二次沉淀并對(duì)其進(jìn)行了初步成分分析，主要成分為粗蛋白(25.97%)、糖類物質(zhì)(25.51%)和灰分(10.02%)。此外，張志航［6］等通過(guò)虹吸和離心法(6 500 r/min，12 min)制備了醬油二次沉淀，并分析了沉淀蛋白質(zhì)的氨基酸組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種，醬油中的二次沉淀蛋白質(zhì)的氨基酸摩爾百分比相近，沉淀蛋白質(zhì)的疏水性比醬油中多肽的疏水性強(qiáng)。曾新安等［7］通過(guò)靜置(共17 d)和濾紙過(guò)濾的方法制備了醬油二次沉淀，其中蛋白質(zhì)、脂肪、總糖、灰分和食鹽含量分別為27.55%、1.99%、16.16%、54.29%和37.00%。陳有容［8］的報(bào)道顯示，醬油通過(guò)55℃加熱處理并靜置沉淀4天制備得到的沉淀，基本成分為89.2%的蛋白質(zhì)、9.6%的碳水化物和1.2%的灰分。由以上分析可知，制備醬油二次沉淀的方法不盡相同，導(dǎo)致后續(xù)的研究結(jié)果存在較大的差異。此外，由于醬油二次沉淀的含量較小，且樣品制備需要的時(shí)間較長(zhǎng)，因此，在相同條件下對(duì)比研究不同方法制備的醬油二次沉淀樣品的組成，并尋找到一種科學(xué)和快速的方法，對(duì)后續(xù)醬油二次沉淀形成機(jī)理的研究尤為重要。

本文在前人研究的基礎(chǔ)上，以靜置法、低溫法、離心法、超聲法及低溫-超聲法分別制備了醬油二次沉淀，并對(duì)比研究了采用不同方法制備的醬油二次沉淀的化學(xué)組成、溶解性能及氨基酸組成。在上述對(duì)比研究的基礎(chǔ)上建立了一種科學(xué)和快速的醬油二次沉淀制備方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

醬油產(chǎn)地:北京;發(fā)酵方式:高鹽稀態(tài);等級(jí):三級(jí)(氨基酸態(tài)氮含量 ≥0.4 g/100 mL);生產(chǎn)原料:脫脂豆粕、小麥粉、食用鹽、水、食品添加劑(焦糖色、谷氨酸鈉、苯甲酸鈉、對(duì)羥基苯甲酸乙丙復(fù)合酯鈉、黃原膠)。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自美國(guó)sigma公司。乙酸鈉、乙氰、三乙胺、CuSO4、亞甲基藍(lán)、酒石酸鉀、亞鐵氰化鉀、葡萄糖、AgNO3、NaOH、四硼酸鈉、Na2HPO4等，均為分析純，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。

1.2.2 主要儀器

高效液相色譜儀，美國(guó)Waters分析儀器有限公司;Kjeitec2300凱氏定氮儀，瑞典FOSS分析儀器有限公司;WFZ UV-2100紫外分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司;H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;5415D高速離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份公司;Freezone 4.5真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco公司;FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 沉淀制備方法

(1)靜置法:醬油(500 mL，玻璃瓶裝)購(gòu)買后室溫靜置10天，虹吸法抽去上清液，留下最后約20 mL醬油和沉淀?yè)u勻后離心收集沉淀，離心參數(shù)4500 r/min，30 min。

(2)直接離心法:將醬油搖勻后進(jìn)行離心分離(4 500 r/min，30 min)，收集離心管底部沉淀。

(3)冷凍法:醬油在0℃冰箱放置24 h，然后離心分離(4 500 r/min，30 min)，收集離心管底部沉淀。

宮頸癌在中國(guó)女性生殖道惡性腫瘤中居第一位，是嚴(yán)重威脅婦女健康的疾病[1]。目前已經(jīng)達(dá)成共識(shí)，持續(xù)的高危型人乳頭瘤病毒感染最終導(dǎo)致了宮頸癌的發(fā)生[2]。為了解一般人群中高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染狀況，我們采用了14種高危型人乳頭瘤病毒核酸檢測(cè)技術(shù)（熒光PCR）進(jìn)行了篩查。

(4)超聲波法:醬油超聲波處理8 min后，然后離心分離(4 500 r/min，30 min)，收集離心管底部沉淀。

(5)低溫-超聲法:醬油超聲波處理8 min，再放入0℃冰箱中冷凍24 h，然后離心分離(4 500 r/min，30 min)，收集離心管底部沉淀。

將收集的沉淀在-40℃下冷凍4 h，冷凍樣品進(jìn)行抽真空冷凍干燥3 d得醬油二次沉淀。制備沉淀后的上清液于常溫下靜置30 d，觀察上清液發(fā)生渾濁和沉淀的情況。

1.3.2 醬油二次沉淀蛋白質(zhì)的溶解性測(cè)定

用K2HPO4、檸檬酸、四硼酸鈉、CaCl2、NaOH 和重蒸水等試劑配制不同pH(2.5～13.5)的緩沖溶液。取0.1 g樣品放入10 mL不同緩沖液中溶解，用振蕩器充分混合，溶液于4500 r/min離心15 min(20℃)，取上清液，用Bradford法［9］測(cè)蛋白質(zhì)濃度。

1.3.3 氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法分別參照GB/T 5009.40-2003和微量凱氏定氮法GB 5009.5-1985，總氮與蛋白質(zhì)的換算系數(shù)以6.25計(jì)算。

1.3.4 NaCl含量的測(cè)定

參照GB/T 5009.39-2003。

1.3.5 總糖的測(cè)定

稱取一定量的醬油二次沉淀(控制最終溶液中總糖含量1～2 g/L)于500 mL容量瓶中，加水50 mL，6 mol/L HCl 5 mL，68 ～70 ℃水浴加熱 15 min。冷卻后加入甲基紅指示液2滴，用NaOH溶液(200 g/L)滴定至紅色消失(近中性)，加水定容、搖均、冷卻后備用。其他步驟參照還原糖測(cè)定方法GB/T 5009.7-2003。

1.3.6 醬油二次沉淀中氨基酸組成分析

總氨基酸的測(cè)定參照 Sun 等［10］和 Yang 等［11］的方法并稍作修改。向盛有約150 mg樣品的水解管中添加6 mL 6 mol/L HCl，加入3～4滴消泡劑，在110℃的烘箱水解24 h，氨基酸經(jīng)苯基異硫酸酯衍生化。色氨酸測(cè)定采用堿水解法，水解條件為4 mol/L NaOH 105℃、24 h。水解液經(jīng)稀釋、定容、濾紙過(guò)濾后備用。采用外標(biāo)法對(duì)氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 聚類分析

聚類分析是以樣品的多個(gè)參數(shù)為變量，研究樣品之間可能存在的潛在“相似性”或“不相似性”，它以樣品之間連線的距離長(zhǎng)短直觀地表示樣品之間的“相似性”或“不相似性”，樣品之間的連線越短表示兩者的“相似性”越高，反之則越低。本研究以樣品中18種氨基酸的含量為變量，以SPSS 11.5中的“between groups linkage”為聚類方法，以“squared Euclidean distance”來(lái)測(cè)量樣品之間的距離，即樣品間的“相似性”和“不相似性”［12］。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均測(cè)定3次，取其平均值。運(yùn)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行方差分析和聚類分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 采用不同方法制備醬油二次沉淀含量的分析

如圖1所示，同一種醬油采用不同的制備方式，所制備的醬油二次沉淀的含量存在一定的差異(0.74～1.67 g/L)。其中，采用靜置法、離心法、低溫法、超聲法所制備的醬油二次沉淀的含量不存在顯著性差異(P＞0.05)，而采用低溫-超聲法制備的醬油二次沉淀的含量比靜置法、離心法、低溫法、超聲法分別提高了125.68%、122.67%、114.10%和98.81%，存在顯著性差異(P＜0.05)。陳杰等［13］采用離心法(4 000 r/min，25 min)分離得到醬油二次沉淀的含量為0.07 g/100 mL，與本實(shí)驗(yàn)采用離心法(4 500 r/min，30 min)制備的醬油二次沉淀的含量(0.75 g/L)比較接近。由于2次實(shí)驗(yàn)所采用的實(shí)驗(yàn)原料不同，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)可比性。因此，有必要在相同條件下對(duì)比研究不同方法制備的醬油二次沉淀的含量及其成分之間的異同，為醬油二次沉淀形成機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

圖1 采用不同方法制備的醬油二次沉淀的量注:柱狀圖上標(biāo)示不同的字母代表不同數(shù)值間存在顯著性差異(P＜0.05)。Fig.1 Contents of secondary precipitates of soy sauce prepared by different methods

2.2 醬油二次沉淀蛋白質(zhì)的溶解性能

由圖2可知，采用不同方法制備的醬油二次沉淀蛋白質(zhì)在pH值2.5～11.5的溶解度為0 mg/mL;采用離心法、低溫-超聲法制備的醬油二次沉淀蛋白質(zhì)的最大溶解度分別為0.008 mg/mL(pH 13.5)和0.068 mg/mL(pH 13.5)。本次實(shí)驗(yàn)用醬油的實(shí)際pH值為4.41，因此可以認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)采用的5種方法所制備的醬油二次沉淀中不含有可溶性蛋白質(zhì)，即5種方法所制備的蛋白質(zhì)均為醬油二次沉淀蛋白質(zhì)。

圖2 醬油二次沉淀蛋白質(zhì)的溶解性能Fig.2 The solubility of proteins in the secondary precipitates from soy sauce

由表1可知，采用上述5種醬油二次沉淀制備方法未破壞醬油上清液的膠體穩(wěn)定性，醬油上清液未發(fā)生渾濁現(xiàn)象。但通過(guò)靜置法制備醬油二次沉淀后剩余的上清液在室溫下儲(chǔ)存30 d后瓶底出現(xiàn)大量土黃色沉淀。通過(guò)離心法、低溫法和超聲法制備醬油二次沉淀后剩余的上清液在后續(xù)的儲(chǔ)存過(guò)程中均出現(xiàn)了較為明顯的土黃色沉淀。但通過(guò)低溫-超聲法制備醬油二次沉淀后的上清液僅在瓶底凹陷處發(fā)現(xiàn)微量的土黃色沉淀。以上現(xiàn)象說(shuō)明低溫-超聲法相對(duì)于靜置法、離心法、低溫法和超聲法是更為科學(xué)和快速的醬油二次沉淀制備方法，同時(shí)也說(shuō)明醬油二次沉淀是個(gè)緩慢、復(fù)雜的形成過(guò)程。

表1 上清液渾濁和再次出現(xiàn)沉淀的情況Table 1 The turbidity and re－precipitation situation of the supernatants prepared by different methods

2.3 醬油二次沉淀常規(guī)指標(biāo)分析

如表2所示，醬油二次沉淀中以NaCl(41.37%～50.20%)、蛋白質(zhì)(20.60% ～26.71%)和總糖(7.45% ～9.87%)為主，同時(shí)含有少量的氨基酸態(tài)氮成分。其中通過(guò)低溫-超聲法制備的醬油二次沉淀中的蛋白質(zhì)含量最高，通過(guò)靜置法制備的醬油二次沉淀中的蛋白質(zhì)含量顯著低于其他4種方法制備的二次沉淀中的蛋白質(zhì)含量(P＜0.05)。此外，通過(guò)低溫-超聲法制備的醬油二次沉淀中的NaCl和總糖含量最少。張志航［5］等報(bào)道的醬油二次沉淀成分(粗蛋白質(zhì)、糖類物質(zhì)和灰分分別為25.97%、25.51%和10.02%)由于通過(guò)透析法去除了NaCl、色素及小分子量的氨基酸和糖類物質(zhì)，因此和本實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果可比性不強(qiáng)。曾新安等［7］通過(guò)靜置(共17 d)和濾紙過(guò)濾的方法制備了醬油二次沉淀，分析結(jié)果顯示醬油二次沉淀中蛋白質(zhì)含量27.55%、總糖16.16%、食鹽37.00%，與本實(shí)驗(yàn)通過(guò)靜置法制備的醬油二次沉淀成分相比，在總糖含量上存在較大的差異，這可能與所使用的樣品存在差異相關(guān)。此外，陳有容［8］曾報(bào)道，醬油二次沉淀的(加熱靜置法)基本成分為89.2%的蛋白質(zhì)、9.6%的碳水化物和1.2%的灰分，這與本實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果差異較大，造成此差異的原因可能為實(shí)驗(yàn)原料不同和醬油二次沉淀制備方法存在差異。由以上分析可知，采用不同的醬油二次沉淀制備方法可能導(dǎo)致研究結(jié)果出現(xiàn)較大的差異，合適的醬油二次沉淀制備方法是研究醬油二次沉淀形成機(jī)理的基礎(chǔ)。因此有必要對(duì)醬油二次沉淀制備的方法進(jìn)行 系統(tǒng)和深入的研究。

表2 醬油二次沉淀的常規(guī)指標(biāo)Table 2 Proximate analysis of secondary precipitates from soy sauce

2.4 醬油二次沉淀中氨基酸組成分析

采用不同方法制備的醬油二次沉淀中蛋白質(zhì)的氨基酸組成如表3所示。按照Fauchere等對(duì)氨基酸的分類方法將氨基酸分為疏水性(疏水值＞0，11種)和親水性氨基酸(疏水值＜0，7種)。經(jīng)ANOVA分析可知，不同樣品間多數(shù)氨基酸(11種)含量不存在顯著性差異(P＞0.05)，但異亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、組氨酸、谷氨酸和賴氨酸的含量存在顯著性差異(P＜0.05)。此外，通過(guò)低溫-超聲法制備的醬油二次沉淀中蛋白質(zhì)的氨基酸含量普遍高于其他4種方法制備樣品的相應(yīng)值，其總疏水性氨基酸含量分別比靜置法、離心法、低溫法和超聲法高15.75%、9.61%、6.78%和9.49%。張志航等［6］曾報(bào)道過(guò)4種醬油中二次沉淀蛋白質(zhì)的氨基酸組成，結(jié)果顯示4種醬油二次沉淀蛋白質(zhì)的氨基酸組成基本相同。以上結(jié)果說(shuō)明，采用不同方法制備的同一種醬油的二次沉淀其氨基酸組成存在較大差異，而采用同一種方法制備的不同醬油的二次沉淀其氨基酸組成差異性較小。因此，要準(zhǔn)確、全面了解醬油二次沉淀形成的機(jī)理，醬油二次沉淀制備的方法一定要科學(xué)、合理。

表3 采用不同方法制備的醬油二次沉淀中蛋白質(zhì)的氨基酸組成Table 3 Amino acids composition of secondary precipitates from soy sauce prepared by different methods

2.5 醬油二次沉淀中氨基酸組成的聚類分析

5種不同方法制備的醬油二次沉淀中蛋白質(zhì)的氨基酸“相似性”如圖3所示，樣品2、3、4首先聚合成一組，然后樣品1并入上述組，最后樣品5與其他樣品聚合成一組。這說(shuō)明樣品2、3、4的氨基酸組成具有較高的“相似性”，樣品1與樣品2、3、4的氨基酸組成具有相對(duì)小的“相似性”，而樣品5與樣品1、2、3、4的氨基酸組成的“相似性”最小(相對(duì)于其他4種樣品的氨基酸組成)。以上現(xiàn)象直觀地說(shuō)明采用不同方法所得樣品的氨基酸組成存在較大差異。

3 結(jié)論

本文通過(guò)靜置法、離心法、低溫法、超聲法及低溫-超聲法制備了醬油二次沉淀，并對(duì)比研究了上述方法制備樣品的溶解性能和化學(xué)組成。主要得到如下結(jié)論:

(1)上述5種方法制備的樣品均為醬油的二次沉淀，其主要成分為NaCl、蛋白質(zhì)、糖類及少量的氨基酸。

(2)低溫-超聲法制備的醬油二次沉淀其蛋白質(zhì)含量明顯高于其他4種方法制備樣品的蛋白質(zhì)含量，而蛋白質(zhì)被認(rèn)為是導(dǎo)致醬油出現(xiàn)二次沉淀的關(guān)鍵因素。因此將醬油中盡可能多的“潛在”沉淀蛋白質(zhì)分離出來(lái)，是研究醬油二次沉淀形成機(jī)理的先決條件和基礎(chǔ)。同時(shí)通過(guò)低溫-超聲法制備的醬油二次沉淀中的NaCl和多糖含量最低。因此，低溫-超聲法是一種更為科學(xué)和快速的制備醬油二次沉淀的方法。

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