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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院黃島院區(qū)心內(nèi)科，山東 青島 266555)

急性心肌梗死后，盡早行再灌注治療可明顯改善心肌的缺血壞死,但是再灌注同時(shí)又可加重心肌的損傷。研究結(jié)果顯示，Rho激酶抑制劑法舒地爾具有擬缺血預(yù)適應(yīng)及缺血后處理的保護(hù)效應(yīng)[1-2]，可顯著減輕心肌缺血再灌注(IR)損傷。已知?jiǎng)用}粥樣硬化發(fā)生的始動(dòng)因素是內(nèi)皮細(xì)胞受損，而Rho激酶可通過(guò)蛋白激酶-C途徑下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶的表達(dá)，降低內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能，促進(jìn)AS的發(fā)展[3]。但在急性心肌IR中，Rho激酶與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能之間的關(guān)系如何，目前鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建大鼠心肌IR模型并予以法舒地爾藥物干預(yù)，觀察其對(duì)再灌注后血管內(nèi)皮功能指標(biāo)一氧化氮(NO)、血管性血友病因子(VWF)及心肌缺血面積的影響，旨在探討Rho激酶抑制劑在急性心肌IR時(shí)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及心肌的保護(hù)作用?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

法舒地爾購(gòu)于天津紅日藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：1203281。大鼠NO、VWF的ELISA試劑盒及伊文藍(lán)購(gòu)于上海越研生物科技有限公司。TTC染液購(gòu)于南京建成生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物

取健康雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量為250～300 g，購(gòu)于青島市藥品檢驗(yàn)所。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及IR模型的建立

30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組(IR組)、法舒地爾組(FH組)，每組10只大鼠。假手術(shù)組,只在大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)處穿一絲線,但不予結(jié)扎。IR及FH組參考文獻(xiàn)[4]的方法，經(jīng)氣管切開(kāi)插管，呼吸機(jī)輔助呼吸，阻斷左冠狀動(dòng)脈30 min后再灌注，構(gòu)建IR模型。FH組于缺血前1 h腹腔注射法舒地爾10 mg/kg，假手術(shù)組及IR組于缺血前1 h腹腔注射等量的生理鹽水。

1.4 血清中NO、VWF水平測(cè)定

分別于再灌注后2、24 h取血，迅速離心，留取血清標(biāo)本，-20 ℃保存。嚴(yán)格按照試劑盒要求，檢測(cè)血清中NO、VWF水平的變化。

1.5 心肌缺血面積的測(cè)定

于再灌注后24 h，經(jīng)大鼠頸總動(dòng)脈注入10 g/L伊文藍(lán)2 mL，2 min后取出完整心臟，沖洗，確定缺血心肌(非缺血區(qū)藍(lán)色，缺血區(qū)白色)。從取出的心臟中分離出左心室(包括室間隔)。從距心尖部位1 cm處，以垂直于左室長(zhǎng)軸的方向切下約2 mm厚的薄片；照相后，37 ℃下放入1 g/L的TTC染色15 min，藍(lán)色區(qū)域?yàn)榉侨毖獏^(qū)，紅色區(qū)域?yàn)槿毖獏^(qū),梗死區(qū)域不著色,拍照，使用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量，并按照公式計(jì)算缺血面積，缺血面積=(缺血區(qū)心外膜長(zhǎng)度+心內(nèi)膜長(zhǎng)度)/(左心室心外膜周長(zhǎng)+心內(nèi)膜周長(zhǎng))×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清中NO、VWF水平比較

與假手術(shù)組相比，IR組再灌注2、24 h后血清中NO含量顯著下降，VWF活性顯著升高，差異有顯著性(F=10.08～118.66，q=6.32～19.80，P<0.01)。與IR組相比，F(xiàn)H組再灌注2、24 h后血清中NO含量明顯升高，VWF活性顯著下降，差異有顯著性(q=3.69～17.77，P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 再灌注24 h后心肌缺血面積比較

IR組與FH組再灌注24 h后心肌缺血面積分別為58.25±13.3、30.67±8.71，兩組比較差異有顯著意義(t=6.01，P<0.05)。

表1 各組大鼠再灌注2、24 h后血清中NO、VWF水平的變化

3 討 論

隨著冠狀動(dòng)脈再通術(shù)的發(fā)展，心肌IR損傷日益受到關(guān)注。研究表明，心肌IR時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化活性大大降低。內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙及NO合成的減少導(dǎo)致中性粒細(xì)胞聚集被激活,并釋放大量氧自由基等毒性產(chǎn)物及破壞性蛋白酶,從而改變血管的通透性，影響冠狀動(dòng)脈微循環(huán)[5]。

研究證實(shí)，心肌缺血預(yù)適應(yīng)與缺血后處理可顯著減輕心肌IR損傷。單亮等[6]通過(guò)比較缺血預(yù)處理、缺血后處理對(duì)急性IR損傷心肌生化指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示，缺血后處理和缺血預(yù)處理具有相似的心肌保護(hù)作用。而目前一些研究顯示，法舒地爾作為Rho激酶抑制劑具有擬心肌缺血預(yù)適應(yīng)及缺血后處理的心肌保護(hù)效應(yīng)。

WOLFRUM等[1]應(yīng)用小鼠在體心肌IR模型進(jìn)行研究,在缺血前1 h腹腔注射FH(10 mg/kg)，結(jié)果顯示，再灌注時(shí)白細(xì)胞聚集及黏附能力明顯降低，并明顯減少心肌梗死面積(減少38%)。另外，HAMID等[2]在缺血35 min和再灌注10 min分別測(cè)定Rho激酶活性,結(jié)果顯示，Rho激酶活性在再灌注時(shí)明顯增高。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，Rho激酶抑制劑與缺血預(yù)適應(yīng)的保護(hù)效應(yīng)存在共同的信號(hào)通路,即通過(guò)PI3激酶-AKT-內(nèi)皮型一氧化氮合酶(e-NOS)信號(hào)途徑作用于細(xì)胞內(nèi)終末靶點(diǎn)[7-8]；而其擬缺血后處理的保護(hù)效應(yīng)則與Rho激酶活性在再灌注時(shí)明顯增高密切相關(guān)[2]。本實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)，相比IR組，在缺血前1 h應(yīng)用法舒地爾可顯著減少IR后心肌缺血面積。

VWF是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種多聚體糖蛋白，其通過(guò)特異的血小板膜受體(糖蛋白Ⅰb-Ⅸ復(fù)合物)介導(dǎo)血小板與內(nèi)皮下層的黏附，其增高有利于血小板的黏附[9]。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到刺激或損傷時(shí),VWF能夠從內(nèi)皮細(xì)胞分泌到血漿或血管內(nèi)皮下,是內(nèi)皮功能損傷的一個(gè)敏感指標(biāo)[10]。

NO在體內(nèi)由NOS催化L-精氨酸產(chǎn)生，其中受鈣調(diào)蛋白可逆性調(diào)節(jié)的e-NOS，可在低水平上調(diào)控NO的產(chǎn)生,參與體內(nèi)多種生理功能的調(diào)節(jié)[11]。NOS在心肌IR中起著重要的作用,尤其e-NOS與冠狀動(dòng)脈舒縮狀態(tài)相關(guān)。已知NO、e-NOS激活介導(dǎo)缺血預(yù)適應(yīng)的延遲保護(hù)效應(yīng),是缺血預(yù)適應(yīng)的保護(hù)機(jī)制之一[12]。近年來(lái)研究顯示，Rho激酶抑制劑可通過(guò)PI3激酶-AKT-e-NOS信號(hào)途徑作用于細(xì)胞內(nèi)終末靶點(diǎn)，對(duì)IR損傷起保護(hù)作用。其具體機(jī)制為：蛋白激酶PI3、AKT可通過(guò)磷酸化e-NOS而調(diào)節(jié)其活性，使e-NOS進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)源性NO產(chǎn)生；NO通過(guò)拮抗內(nèi)皮素、促進(jìn)血管擴(kuò)張、保護(hù)內(nèi)皮功能、抑制血小板聚集、抑制心肌和血管內(nèi)超氧化物形成等發(fā)揮保護(hù)作用[13]。

本實(shí)驗(yàn)同樣表明，在急性心肌IR時(shí)血清中NO含量降低、VWF活性升高,可能原因?yàn)镮R后氧自由基產(chǎn)生增加,內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化活性下降，發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化損傷,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙所致。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示，應(yīng)用法舒地爾干預(yù)治療后，再灌注時(shí)血清中NO含量較IR組有所增加，VWF活性有所下降，表明法舒地爾可能通過(guò)抑制Rho激酶活性及激活細(xì)胞內(nèi)PI3激酶-AKT-e-NOS信號(hào)通路，促進(jìn)再灌注期NO的合成，減少內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而降低VWF的分泌。

以往研究表明，Rho/Rho激酶可通過(guò)多種信號(hào)途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡和細(xì)胞周期。而法舒地爾作為Rho激酶抑制劑，可抑制缺血狀態(tài)下心肌細(xì)胞的凋亡，降低梗死面積。本實(shí)驗(yàn)從另外一方面證實(shí)，Rho激酶抑制劑可顯著保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，為臨床上冠狀動(dòng)脈再通后的藥物治療提供更多可能證據(jù)。

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