沈萬(wàn)斌，周楠楠，李一楠，郭志勇，李耀睿，花修藝，董德明

地下水資源與環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/水資源與水環(huán)境吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/吉林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，長(zhǎng)春 130012

0 前言

pH是表征水環(huán)境生物地球化學(xué)特征的重要參數(shù)之一［1］。水體中的生物擾動(dòng)主要指水/沉積物界面附近的底棲動(dòng)物所產(chǎn)生的擾動(dòng)作用，其對(duì)上覆水/沉積物體系中物質(zhì)的遷移和微環(huán)境的物理與化學(xué)特征均有顯著影響［2－3］。體系的pH分布特征也會(huì)受生物擾動(dòng)的影響而發(fā)生顯著改變，進(jìn)而影響體系污染物的環(huán)境地球化學(xué)行為和遷移轉(zhuǎn)化特征［4］。因此生物擾動(dòng)存在下沉積物中pH等重要環(huán)境地球化學(xué)參數(shù)的時(shí)空分布與變化規(guī)律開(kāi)始受到越來(lái)越多的關(guān)注［5－8］。傳統(tǒng)電化學(xué)測(cè)量法只能對(duì)上覆水和沉積物pH進(jìn)行一維的破壞性測(cè)量。近年來(lái)，用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域的熒光平面光極技術(shù)開(kāi)始被應(yīng)用于環(huán)境領(lǐng)域［9－13］。其基本原理是利用熒光物質(zhì)與不同濃度的待測(cè)物質(zhì)作用前后其熒光波長(zhǎng)或強(qiáng)度發(fā)生改變，且這種改變可定量反映待測(cè)物含量［14］；把這些熒光物質(zhì)制成平面?zhèn)鞲心ぃㄆ矫婀鈽O），通過(guò)采集和處理傳感膜的熒光圖像可得到待測(cè)物的二維定量分布圖［15］。目前已有少量用平面光極進(jìn)行沉積物pH等參數(shù)二維分布測(cè)量的研究，但都集中在海洋沉積物上，對(duì)淡水沉積物的研究未見(jiàn)報(bào)道［16－17］。上述研究多是基于熒光絕對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行定量，因而存在光學(xué)路徑、背景光、光漂白和光源穩(wěn)定性等因素會(huì)影響結(jié)果準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的缺陷［18］。鑒于此，本研究首先對(duì)傳感膜制備方法和熒光圖像采集與定量方法進(jìn)行改進(jìn)，構(gòu)建用于淡水環(huán)境的pH二維分布監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)研究有生物擾動(dòng)存在的模擬水/沉積物體系中pH的二維時(shí)空分布特征，以期進(jìn)一步了解生物擾動(dòng)對(duì)微環(huán)境地球化學(xué)特征的影響，進(jìn)而深入認(rèn)識(shí)水環(huán)境中污染物的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 pH平面光極系統(tǒng)的制作

pH平面?zhèn)鞲心さ闹苽浞椒▍⒖嘉墨I(xiàn)［16，19－20］，簡(jiǎn)述如下：先把聚乙烯醇（PVA）、烯丙醇、戊二醛和鹽酸混合反應(yīng)，所得凝膠產(chǎn)物平鋪于聚酯薄膜表面，形成連有乙烯基的PVA膜；然后以8－羥基－1，3，6－三磺酸芘鈉（HPTS）為熒光指示劑，先與五氯化磷反應(yīng)生成磺酰HPTS，磺酰HPTS再與丙烯胺反應(yīng)，生成HPTS－丙烯胺交聯(lián)劑；最后把連有乙烯基的PVA膜浸泡在HPTS－丙烯胺交聯(lián)劑、過(guò)二硫酸銨、丙烯酰胺和四甲基乙二胺的混合溶液中，使HPTS化學(xué)交聯(lián)到PVA膜上。與文獻(xiàn)相比，本研究在傳感膜制作過(guò)程中主要有2點(diǎn)改進(jìn)：一是在0℃制備連有乙烯基的PVA凝膠，并通過(guò)凍干來(lái)干燥PVA膜，避免了溫度對(duì)反應(yīng)的影響，也保證了PVA膜的均一性；二是同樣用凍干方式獲取HPTS－丙烯胺交聯(lián)劑，避免了產(chǎn)物的分解和轉(zhuǎn)化。這些改進(jìn)有效提高了傳感膜的穩(wěn)定性和熒光性能。

用熒光分光光度計(jì)（F－2700，日立）測(cè)定所制備的pH傳感膜在不同pH的磷酸鹽緩沖溶液中的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜，確定其最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)及最佳pH檢測(cè)范圍。然后選擇6.6和8.2分別作為較低和較高pH值的代表，檢測(cè)傳感膜對(duì)pH變化的響應(yīng)時(shí)間、可逆性和穩(wěn)定性。即在把傳感膜放入pH為8.2的緩沖溶液中浸泡30s后，每隔3s檢測(cè)一次熒光強(qiáng)度，連續(xù)監(jiān)測(cè)10次；再把傳感膜取出并用去離子水潤(rùn)洗后轉(zhuǎn)移到pH為6.6的緩沖溶液中浸泡30s，同樣每3s檢測(cè)一次熒光強(qiáng)度至10次；再把該膜經(jīng)潤(rùn)洗后放回pH為8.2的緩沖溶液中進(jìn)行同樣測(cè)定，如此循環(huán)測(cè)試6次；最后再把該傳感膜在4℃下保存15d后進(jìn)行同樣測(cè)定?；趥鞲心さ膒H平面光極監(jiān)測(cè)系統(tǒng)包括待測(cè)裝置（傳感膜）、光源和圖像采集裝置。傳感膜的敏感面與待測(cè)物（底泥）直接接觸，豎直放置，另一面面向光源和圖像采集裝置。紫外光源為波長(zhǎng)可調(diào)的300W氙燈（130Xe，蘇州一村光電），圖像采集裝置為高分辨率數(shù)碼相機(jī)（佳能EOS 5DMark II，配50mm鏡頭）。根據(jù)傳感膜的最大發(fā)射波長(zhǎng)，相機(jī)鏡頭前放置中心波長(zhǎng)為511nm的濾光片。為避免反光影響，相機(jī)正對(duì)傳感膜而光源與傳感膜觀測(cè)面呈30°角。所采集 的 圖 像 用 Image－Pro plus（6.0 版，Media Cybernetics Inc.）軟件進(jìn)行分析和計(jì)算，得到pH的平面分布等值線圖。

1.2 生物擾動(dòng)下水/沉積物模擬體系pH二維時(shí)空分布的監(jiān)測(cè)

淡水沉積物樣品采自長(zhǎng)春南湖，取表層沉積物，過(guò)60目篩除雜質(zhì)，然后冷凍處理去除沉積物中可能存在的底棲生物和蟲(chóng)卵。擾動(dòng)生物顫蚓與沉積物采自同一地點(diǎn)，所采顫蚓在微量礦物鹽（MMS）溶液［5］中培養(yǎng)適應(yīng)一周后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

用長(zhǎng)、寬、高分別是10、10和20cm的自制石英杯模擬水/沉積物體系。先把pH傳感膜（10cm×15cm）放入杯中，其非敏感面緊貼石英玻璃壁。再向燒杯中小心加入10cm深已均質(zhì)化的沉積物，使沉積物緊密接觸傳感膜的敏感面；在沉積物上方小心加入深度為5cm的MMS溶液和約600條顫蚓。顫蚓在模擬裝置中適應(yīng)24h后再開(kāi)始計(jì)時(shí)和圖像采集。圖像采集在遮光條件下分別在2個(gè)選定的波長(zhǎng)下進(jìn)行。采集時(shí)在傳感膜后2cm處放置黑色擋光片，并把石英杯除觀測(cè)面外用黑布包裹。圖像采集每24h一次，連續(xù)進(jìn)行14d。在此期間，用毛細(xì)管向裝置的上覆水中緩慢通空氣（拍照時(shí)除外），以保證生物的活性。模擬實(shí)驗(yàn)裝置和圖像采集系統(tǒng)如圖1所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH平面?zhèn)鞲心さ臒晒馓卣骱突拘阅?/h3>

2.1.1 不同pH下平面?zhèn)鞲心さ臒晒馓卣?/p>

不同pH下傳感膜的熒光光譜見(jiàn)圖2。通過(guò)對(duì)傳感膜熒光光譜的初步掃描并結(jié)合文獻(xiàn)［20］，可確定傳感膜的最大發(fā)射波長(zhǎng)在511nm附近。以511 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，在系列pH緩沖溶液中測(cè)得的傳感膜激發(fā)的光譜見(jiàn)圖2A。由圖可見(jiàn)，所制備的傳感膜有兩個(gè)最大激發(fā)波長(zhǎng)，分別為404nm和453nm，且這2個(gè)波長(zhǎng)所激發(fā)熒光的強(qiáng)度均與pH相關(guān)。這2個(gè)波長(zhǎng)分別對(duì)應(yīng)膜上HPTS的酸式和堿式形態(tài)的最大激發(fā)波長(zhǎng)［6］。分別以404nm和453nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在系列緩沖溶液中測(cè)得的傳感膜的發(fā)射光譜見(jiàn)圖2B和C，可知：2個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)下傳感膜的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)均在511nm附近，且激發(fā)波長(zhǎng)為404nm時(shí)傳感膜的熒光強(qiáng)度隨pH的增加而減小；而激發(fā)波長(zhǎng)為453nm時(shí)熒光強(qiáng)度隨pH的增加而增加。

圖1 有生物擾動(dòng)存在的水/沉積物模擬體系的實(shí)驗(yàn)裝置和熒光圖像采集系統(tǒng)Fig.1 Simulated freshwater/sediment microcosm and the fluorescence image acquisition system

圖2 不同pH下pH平面?zhèn)鞲心さ臒晒夤庾VFig.2 Fluorescence spectra of pH planar sensor at different pH values

由于該傳感膜有2個(gè)最大激發(fā)波長(zhǎng)，且這2個(gè)波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度隨pH呈相反變化趨勢(shì)。因此為了提高檢測(cè)的靈敏度，可將這2個(gè)波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行差減，建立熒光強(qiáng)度差與pH的關(guān)系，見(jiàn)圖2D。由圖可見(jiàn)，熒光強(qiáng)度差與pH間呈近似“S”型變化，其中在pH為6.2到8.6的范圍內(nèi)可根據(jù)差值對(duì)pH進(jìn)行定量，而該范圍恰好也是天然水的常見(jiàn)pH范圍。在pH為6.6到7.8的范圍內(nèi)，差值隨pH呈近乎線性的變化，此時(shí)傳感膜具有最高pH檢測(cè)靈敏度。

2.1.2 pH平面?zhèn)鞲心さ捻憫?yīng)時(shí)間、可逆性和穩(wěn)定性

圖3為對(duì)pH平面?zhèn)鞲心さ捻憫?yīng)時(shí)間、可逆性和穩(wěn)定性的測(cè)試結(jié)果。由圖3可見(jiàn)：傳感膜的響應(yīng)時(shí)間很短，小于30s（浸泡時(shí)間）；傳感膜具有很好的可逆性，每個(gè)pH轉(zhuǎn)換周期結(jié)束后其熒光強(qiáng)度差值基本不變，兩批測(cè)定的2個(gè)pH的熒光強(qiáng)度差值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不超過(guò)1.3%；傳感膜也具有較好的穩(wěn)定性，15d前后進(jìn)行的兩批測(cè)定的結(jié)果較接近，其中pH＝8.2時(shí)兩批測(cè)定的熒光強(qiáng)度差值平均值的相對(duì)偏差為7.9%，pH＝6.6時(shí)兩批測(cè)定的強(qiáng)度差值平均值的相對(duì)偏差為4.4%。與類(lèi)似研究得到的熒光pH平面?zhèn)鞲心は啾龋狙芯克脗鞲心さ捻憫?yīng)時(shí)間、可逆性和穩(wěn)定性等性能更優(yōu)或與之接近。如Zhu等［7，16］制備的pH平面?zhèn)鞲心ば?min才能達(dá)到正常熒光響應(yīng)值的90%，200次循環(huán)測(cè)定的偏差為5%～9%；Stahl等［17］制備的傳感膜的響應(yīng)時(shí)間＜200s，連續(xù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為2%～7%，15h信號(hào)強(qiáng)度降低8%，可穩(wěn)定使用的時(shí)間＞3d；Str?mberg等［20］的傳感膜在pH 為6.6到7.7的范圍內(nèi)響應(yīng)時(shí)間約為100s。本研究所制備的pH傳感膜的快速響應(yīng)及良好的可逆性和穩(wěn)定性保證了它可以用于水/沉積物體系中pH二維分布的連續(xù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

2.2 pH平面光極系統(tǒng)在生物擾動(dòng)下的淡水/沉積物體系中的應(yīng)用

單一激發(fā)波長(zhǎng)下采集的熒光圖像會(huì)受光路徑、背景光、光漂白和光源穩(wěn)定性等影響，不能準(zhǔn)確反映樣品的真實(shí)信息［21］。由2.1.1可知，本傳感膜的2個(gè)最大激發(fā)波長(zhǎng)所激發(fā)的熒光強(qiáng)度差與pH間存在可定量的關(guān)系。因此，pH平面光極的二維熒光圖像可采用同樣方法處理，即在511nm處分別采集激發(fā)波長(zhǎng)為453nm和404nm的熒光圖像，把2個(gè)圖像轉(zhuǎn)化為浮點(diǎn)圖后進(jìn)行差減，根據(jù)差值圖中熒光強(qiáng)度差與pH間的定量關(guān)系，得到pH二維分布等值線圖。這不僅提高了檢測(cè)的靈敏度，也克服了前述單一激發(fā)波長(zhǎng)下直接采集圖像的缺陷。

圖3 pH平面?zhèn)鞲心ぴ?個(gè)pH下的交替響應(yīng)Fig.3 Response of pH planar sensor to two alternant pH values

圖4為模擬體系第6天的原始熒光圖像及處理后圖像：圖4A和B分別是激發(fā)波長(zhǎng)為453、404nm時(shí)體系的熒光圖像（511nm處）；圖4C為A減B的差值圖；圖4D為C添加偽色后得到的pH二維分布等值線圖。對(duì)比圖4A和B可看出：兩圖均為上覆水熒光強(qiáng)度高而沉積物熒光強(qiáng)度低；但A的上覆水與沉積物的熒光強(qiáng)度差別較大而B(niǎo)中兩者強(qiáng)度更接近。這也說(shuō)明直接采集的圖像存在前述背景光干擾等因素。圖4C中，上覆水和沉積物間的亮度差異減小，表明背景光等干擾因素基本被克服。從圖4D可直觀看出：沉積物主體pH較低，為6.6～7.0，且隨深度增加有所增加；上覆水pH較高，為7.5～7.8；在水/沉積物界面附近pH變化劇烈。可見(jiàn)，利用本平面光極系統(tǒng)及圖像處理方法，可得到直觀反映體系pH二維分布特征的pH分布圖。

2.3 生物擾動(dòng)下水/沉積物模擬體系pH的分布與變化特征

圖4 平面光極系統(tǒng)所采集的水/沉積物體系的熒光圖及計(jì)算所得的pH二維分布圖Fig.4 Fluorescence images obtained by planar optode in water/sediment system and the calculated two－dimensional pH isograms

圖5 生物擾動(dòng)存在下水/沉積物體系中pH的二維時(shí)空分布Fig.5 Two－dimensional spatial and temporal distribution of pH in bioturbated water/sediment system

利用平面光極系統(tǒng)對(duì)水/沉積物模擬體系pH二維分布連續(xù)14d監(jiān)測(cè)的結(jié)果見(jiàn)圖5?？傮w上上覆水pH較高而沉積物pH較低，上覆水pH的時(shí)空變化較大而沉積物pH的變化較小，與很多類(lèi)似研究結(jié)果一致［8，16－17］。對(duì)于沉積物而言，其主體pH 一般為6.6～7.0且時(shí)空變化小，體現(xiàn)了其對(duì)pH較強(qiáng)的緩沖能力。由于沉積物在裝入實(shí)驗(yàn)裝置前進(jìn)行了均質(zhì)化，所以前2d沉積物pH的空間分布很均勻。從第3天開(kāi)始，由于體系中（特別是界面附近）的各種反應(yīng)，沉積物開(kāi)始呈表層pH略高而下層略低的趨勢(shì)［22］。實(shí)驗(yàn)后期，特別是12d以后，除界面附近外，沉積物pH的空間分布重新趨于均勻，這主要是擾動(dòng)生物的混合作用的結(jié)果［23］。類(lèi)似趨勢(shì)從水/沉積物界面的形狀也可看出。對(duì)于上覆水而言，其pH一般為6.6～8.0，且時(shí)空變化較顯著?？傮w上，上覆水pH隨時(shí)間先升高，后逐漸下降并趨于穩(wěn)定；沉積物附近上覆水pH與上覆水主體pH間呈較大差異，體現(xiàn)了沉積物對(duì)上覆水pH的影響。第1d上覆水pH與沉積物基本一致，這主要是由于填裝實(shí)驗(yàn)裝置時(shí)的混合作用以及此時(shí)主要在沉積物表層活動(dòng)的擾動(dòng)生物的作用而導(dǎo)致的沉積物和水間的物質(zhì)交換。底層水pH較低可能還與沉積物顆粒表面一些低價(jià)金屬的釋放和氧化有關(guān)［4，7，18］。第2－8天，上覆水pH逐漸升高，主要是由于上覆水中顆粒物的沉降（主要是前3d），以及沉積物中氨等成分的釋放（前7d）［7，24］；第8天起，隨著使pH 升高的因素影響的逐漸結(jié)束，上覆水主體pH受底層上覆水?dāng)U散作用等的影響而逐漸下降，并最終穩(wěn)定在7.5附近；界面附近上覆水pH由于沉積物的緩沖作用及沉積物中釋放的低pH孔隙水的作用而一直較低（約7.4）。

擾動(dòng)生物顫蚓在模擬體系中主要起搬運(yùn)混合顆粒物與溶質(zhì)、降低溶解氧和增加有機(jī)質(zhì)的新陳代謝作用［25］。搬運(yùn)混合作用一方面會(huì)使沉積物內(nèi)部（孔隙水）、水/沉積物界面附近甚至上覆水主體的pH趨于均一［26］，如前述上覆水中的懸浮顆粒導(dǎo)致上覆水pH下降、界面附近沉積物對(duì)上覆水pH的影響等均有生物擾動(dòng)的混合作用的貢獻(xiàn)；另一方面又會(huì)促進(jìn)沉積物中物質(zhì)向上覆水釋放、或把上覆水中的物質(zhì)輸送到沉積物中，使這些物質(zhì)由于氧化還原條件等條件的改變而可能發(fā)生涉及H＋轉(zhuǎn)移的化學(xué)反應(yīng)，改變其周?chē)膒H［27］，如顫蚓可促進(jìn)厭氧沉積物中Fe2＋等低價(jià)金屬釋放到界面附近并發(fā)生氧化，降低體系（特別是界面附近上覆水）的pH［4，18］。顫蚓的新陳代謝活動(dòng)主要起降低體系氧化還原電位的作用［5］，能通過(guò)影響一些化學(xué)反應(yīng)的平衡而影響體系pH，如顫蚓的存在會(huì)促進(jìn)沉積物中的反硝化作用，使氮轉(zhuǎn)化為氨并釋放到上覆水，提高體系的pH［7，24］。由于模擬體系本身的變化以及擾動(dòng)生物的存在，因此體系中存在多種影響pH的作用，而體系pH的變化正是這些綜合作用的結(jié)果。由于影響因素的復(fù)雜性，且不同階段主導(dǎo)因素不同，因此體系（特別是上覆水）的pH是動(dòng)態(tài)變化的。

本研究證實(shí)了生物擾動(dòng)作為重要影響因素之一，對(duì)淡水/沉積物體系pH有一定的影響，這種影響又必然會(huì)影響體系中重金屬等污染物的遷移轉(zhuǎn)化。低pH往往使重金屬有更高的移動(dòng)性和生物可利用性，而高pH會(huì)使金屬更容易被固相物質(zhì)束縛［28］。Atkinson等［29］發(fā)現(xiàn)上覆水和沉積物pH 的細(xì)微變化往往比體系溶解氧和鹽度等的變化更能影響重金屬的釋放。本模擬研究中，沉積物內(nèi)部的重金屬可能會(huì)有向表層遷移的趨勢(shì)，而上覆水中重金屬的濃度可能會(huì)隨上覆水pH的變化而呈先下降再上升的趨勢(shì)。

3 結(jié)論

1）利用改進(jìn)方法制備了基于鍵合HPTS的、具有2個(gè)對(duì)pH敏感的激發(fā)波長(zhǎng)且這2個(gè)波長(zhǎng)激發(fā)的熒光隨pH成相反變化趨勢(shì)的平面熒光傳感膜。

2）利用所制備的平面熒光傳感膜，構(gòu)建了基于平面光極的pH二維分布實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，建立了利用2個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)的熒光相差減來(lái)獲取pH分布等值線圖的方法。該方法可以很好地記錄模擬淡水/沉積物體系中pH的時(shí)空變化規(guī)律。

3）生物擾動(dòng)存在下淡水/沉積物體系的pH存在動(dòng)態(tài)的空間變化，沉積物自身pH時(shí)空變化較小但對(duì)上覆水pH有重要影響，上覆水pH存在顯著而復(fù)雜的變化。這些變化是多種機(jī)制綜合作用的結(jié)果，而生物擾動(dòng)對(duì)這些作用均有一定影響。

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