杜士明，杜婷，王剛，葉方，孫榮進(jìn)，陳科力 （.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院，湖北 十堰，44000；.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源和中藥復(fù)方教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢，430065）

竹葉柴胡（Bupleurum marginatum Wall.ex DC.）為傘形科柴胡屬植物，主要分布于四川、湖北、陜西、云南、貴州、湖南等地［1］。長(zhǎng)期以來，鄂西北地區(qū)所產(chǎn)的柴胡習(xí)慣以“北柴胡”之名經(jīng)銷全國各地，并在中藥市場(chǎng)上享有較高的聲譽(yù)。但本課題組對(duì)鄂西北地區(qū)柴胡資源調(diào)查結(jié)果表明，本地區(qū)野生柴胡品種均為竹葉柴胡，尚未發(fā)現(xiàn)有野生和人工栽培的北柴胡［2］?！吨袊幍洹?010 年版收載的柴胡品種為北柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狹葉柴胡（B.scorzonerifolium Willd.南柴胡）的干燥根入藥，而竹葉柴胡被云南、四川、貴州等省的地方標(biāo)準(zhǔn)所收載［3］。文獻(xiàn)報(bào)道鄂西北地區(qū)所產(chǎn)竹葉柴胡皂苷含量較高［4］，本課題組前期研究也表明鄂西北各產(chǎn)地竹葉柴胡的皂苷含量均符合藥典北柴胡含量測(cè)定項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步比較竹葉柴胡和北柴胡的解熱及鎮(zhèn)痛藥理作用，觀察其是否有差異，為竹葉柴胡的臨床應(yīng)用和后續(xù)的開發(fā)研究提供借鑒和依據(jù)。

1 材料與試劑

JJ200電子天平（美國兄弟公司）；MH－1000調(diào)溫型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）；RE－52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；MT－101型電子體溫計(jì)（杭州世佳電子有限公司）；501型超級(jí)恒溫器（上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

竹葉柴胡，產(chǎn)地：湖北房縣，購于湖北神農(nóng)本草中藥飲片有限公司（批號(hào)20111220）；北柴胡，產(chǎn)地：山西運(yùn)城，由山西運(yùn)城北柴胡種植基地提供（批號(hào)20111020），上述飲片經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)陳科力教授鑒定分別為竹葉柴胡（Bupleurum marginatum Wall.ex DC.）與 北 柴 胡（Bupleurum chinense DC.）；2，4－二硝基苯酚；氫氧化鈉；醋酸；對(duì)乙酰氨基酚片（四川省旺林堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)120202）。

SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄各半，動(dòng)物合格證號(hào)：No.4200900016；昆明種小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄兼取，動(dòng)物合格證號(hào)：No.4200900008，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2011－0031，均由湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 方法

2.1 飲片提取液的制備

2.1.1 水煎液的制備 分別稱取適量竹葉柴胡和北柴胡，加8倍量的水煎煮2次，每次1.5h，過濾、合并濾液，減壓濃縮，加水調(diào)配成濃度為每毫升相當(dāng)于0.5g生藥的儲(chǔ)備液，備用。

2.1.2 醇提液的制備 分別稱取適量竹葉柴胡和北柴胡，加8倍量的60%乙醇（調(diào)pH 7～8），80 ℃回流2h，過濾，收集濾液，濾渣重復(fù)提取1次，合并濾液，減壓濃縮至無乙醇味［5］，加水調(diào)濃度制成每毫升相當(dāng)于0.5g生藥的儲(chǔ)備液，備用。

2.2 大鼠解熱作用研究

2.2.1 2，4－二硝基苯酚溶液制備 稱取2，4－二硝基苯酚150 mg，加80 mL 生理鹽水，滴加5 mol·L－1的氫氧化鈉溶液，邊加邊攪拌使之溶解，再加生理鹽水至100mL，搖勻，備用。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的篩選 參照文獻(xiàn)［6］中的方法，實(shí)驗(yàn)前用電子體溫計(jì)測(cè)正常肛溫，每天2次，連續(xù)3 d，測(cè)量肛溫（插入大鼠肛門距離2cm 左右）。將體溫變化（ΔT＞0.5 ℃）及單次體溫高于38 ℃的大鼠剔除。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)方法 篩選出體溫合格的大鼠48只，隨機(jī)分為6組，每組動(dòng)物8只，分別為竹葉柴胡水煎液高劑量（ZG，5.0g·kg－1·d－1）、低劑量組（ZD，2.5 g·kg－1·d－1）；北柴胡水煎液高劑量（BG，5.0g·kg－1·d－1）、低劑量組（BD，2.5g·kg－1·d－1）；正常對(duì)照組（K）、模型對(duì)照組（M）給予同等容量的純化水（10.0 mL·kg－1）。實(shí)驗(yàn)前24h 大鼠禁食不禁水，造模前稱重，1h 內(nèi)測(cè)大鼠直腸溫度2 次，取均值作為基礎(chǔ)體溫值。每天灌胃1次，連續(xù)給藥4d，末次灌胃給藥60min后，除正常對(duì)照組外，其他各組大鼠按0.1mL·kg－1背部皮下注射0.15%的2，4－二硝基苯酚溶液，然后于0.5，1，1.5，2，2.5，3h 測(cè)體溫一次，以基礎(chǔ)體溫為基數(shù)，計(jì)算各測(cè)定時(shí)間點(diǎn)大鼠的體溫變化ΔT（℃）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，ΔT 為縱坐標(biāo)繪制體溫變化曲線，并計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組在體溫達(dá)到峰值后的下降幅度ΔT′（℃）。

2.3 小鼠鎮(zhèn)痛試驗(yàn)

2.3.1 熱板法 調(diào)節(jié)超級(jí)恒溫器，控制溫度在（55±0.5）℃，用秒表記錄小鼠自投入熱板后第一次出現(xiàn)舔后足的時(shí)間（s）作為該鼠的痛閾值。挑選在5～30s內(nèi)反應(yīng)穩(wěn)定、不跳躍的小鼠80只備用。

將80只小鼠隨機(jī)分成10組，每組8只，分別為竹葉柴胡水煎液高、低劑量組（劑量為10.0g·kg－1和5.0g·kg－1）；竹葉柴胡醇提液高、低劑量組（劑量為10.0g·kg－1和5.0g·kg－1）；北柴胡水煎液高、低劑量組（劑量為10.0g·kg－1和5.0g·kg－1）；北柴胡醇提液高、低劑量組（劑量為10.0g·kg－1和5.0g·kg－1）；陽性對(duì)照組給予0.2g·kg－1的對(duì)乙酰氨基酚，每天灌胃1次，連續(xù)給藥4d，模型對(duì)照組給予等容量的純化水。于末次給藥后1.0h分別測(cè)定各鼠痛閾值，計(jì)算痛閾抑制率。痛閾抑制率（%）＝（給藥后痛閾值－給藥前痛閾值）／給藥前痛閾值×100%。2.3.2 扭體法 小鼠80只，隨機(jī)分為10組，每組8只，雌雄各半，稱重并記錄，分組給藥同“2.3.1”項(xiàng)，每天灌胃1次，共4d。末次給藥后1.0h，腹腔注射0.5%醋酸10mL·kg－1，觀察15min內(nèi)各組動(dòng)物扭體反應(yīng)（腹部收縮，身體扭曲，伸展后肢，臀部抬高）次數(shù)，計(jì)算扭體抑制率。扭體抑制率（%）＝（陰性對(duì)照組平均扭體次數(shù)－給藥組平均扭體次數(shù)）／對(duì)照組平均扭體次數(shù)×100%，比較各組受試藥物之間的扭體抑制率。

3 結(jié)果

3.1 解熱作用 如圖1、表1所示，各組大鼠皮下注射2，4－二硝基苯酚后，2.0h內(nèi)體溫顯著上升，1.5～2.0h達(dá)到峰值，與基礎(chǔ)體溫比較，除正常對(duì)照組外，各組大鼠的體溫變化均大于0.8 ℃，表明造模成功。與模型組比較，竹葉柴胡、北柴胡給藥組大鼠體溫變化（ΔT，T1.5h與T3.0h體溫差值）、ΔT1.5h（T1.5h與基礎(chǔ)值體溫差值），計(jì)算體溫下降幅度（%）＝ΔT／ΔT1.5h×100%）均有顯著性差異（P＜0.05），表明2種柴胡均有降低大鼠體溫的作用；竹葉柴胡與北柴胡給藥組之間比較結(jié)果表明，兩者降低大鼠體溫的作用差異無顯著性（P＞0.05），提示竹葉柴胡與北柴胡的解熱作用相似；不同劑量組竹葉柴胡與北柴胡給藥組的解熱作用差異也無顯著性（P＞0.05），見表2。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的體溫變化趨勢(shì)—◆—K；—■—M；—▲—BG；—□—BD；—○—ZG—●—ZDFig 1 The changing trend of the temperature at different time intervals—◆—K；—■—M；—▲—BG；—□—BD；—○—ZG—●—ZD

3.2 熱板致痛模型鎮(zhèn)痛作用的比較 表3表明，與模型對(duì)照組比較，竹葉柴胡、北柴胡水煎液組差異均有顯著性（P＜0.05），而兩者醇提液組差異均無顯著（P＞0.05），提示2種柴胡水煎液均有鎮(zhèn)痛作用，而醇提液鎮(zhèn)痛作用不明顯；痛閾抑制率比較結(jié)果表明，竹葉柴胡與北柴胡水煎液之間差異無顯著性（P＞0.05）。

3.3 醋酸致痛模型鎮(zhèn)痛作用的比較 表4結(jié)果顯示，與模型組比較，各給藥組扭體百分率均有顯著性差異（P＜0.05），提示2種柴胡的水煎液和醇提液對(duì)醋酸所致疼痛模型的小鼠均有鎮(zhèn)痛作用；北柴胡與竹葉柴胡之間差異無顯著性（P＞0.05）；2種柴胡不同劑量組間的鎮(zhèn)痛效果差異也無顯著性（P＞0.05），表明北柴胡與竹葉柴胡在醋酸致痛模型的鎮(zhèn)痛作用方面相近。

4 討論

研究表明，柴胡揮發(fā)油部分、黃酮部分和其他物質(zhì)在解熱效應(yīng)中發(fā)揮重要作用，能協(xié)同增強(qiáng)解熱效果；而皂苷部分具有明顯的拮抗作用［7］。本實(shí)驗(yàn)前期研究表明，柴胡醇提液中皂苷含量較高，而水煎液與臨床常用的劑型更為接近，所以在考察解熱作用時(shí)只選擇了2種柴胡的不同提取液進(jìn)行解熱作用比較。結(jié)果表明2種柴胡的不同提取液均有明顯的解熱、鎮(zhèn)痛作用，兩者的解熱作用相近，差異無顯著性，可能與2種柴胡的解熱成分相似有關(guān)；研究也發(fā)現(xiàn)2種不同劑量組之間解熱作用無顯著性差異，由于柴胡解熱作用是通過調(diào)節(jié)下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，影響致熱原、抗炎及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力實(shí)現(xiàn)的［8］，這說明了這2種柴胡可能通過調(diào)節(jié)下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，達(dá)到一定的解熱效應(yīng)之后，與用藥劑量無明顯的相關(guān)性。

表1 各治療組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體溫的變化（±s，n＝8）Tab 1 The change of the temperature at different time intervals（±s，n＝8）

表1 各治療組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體溫的變化（±s，n＝8）Tab 1 The change of the temperature at different time intervals（±s，n＝8）

表2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠體溫的下降幅度（n＝8）Tab 2 The drop of the temperature（n＝8）

表3 熱板試驗(yàn)結(jié)果（n＝8）Tab 3 The results of hot plate test（n＝8）

表4 醋酸致痛試驗(yàn)結(jié)果（n＝8）Tab 4 The results of HAc－induced writhing response（n＝8）

不同劑量的竹葉柴胡與北柴胡解熱作用結(jié)果（表2）表明，竹葉柴胡低劑量組大鼠體溫降幅較為顯著（94.18%），更接近于基礎(chǔ)體溫，其他給藥組在第3小時(shí)節(jié)段體溫均低于模型組，各組沒有明顯差異。在熱板法和醋酸扭體鎮(zhèn)痛試驗(yàn)中，竹葉柴胡與北柴胡低劑量組均有明顯的鎮(zhèn)痛作用，均好于高劑量組，但2 種柴胡各組之間差異無顯著性（P＞0.05）。這些說明柴胡對(duì)用藥劑量非常敏感，藥用時(shí)要根據(jù)不同的治療用途進(jìn)行辨證給藥，當(dāng)以解熱為主要用途時(shí)可用稍大的劑量，而以鎮(zhèn)痛為主要用途時(shí)應(yīng)使用適當(dāng)較小的劑量，以合理使用柴胡達(dá)到較佳的治療效果。

在鎮(zhèn)痛試驗(yàn)中，熱板法是經(jīng)典快痛實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停m合于評(píng)價(jià)中樞鎮(zhèn)痛的藥物，而醋酸扭體法是引起較深的、大面積而持久的疼痛刺激，適合于外周鎮(zhèn)痛研究，故本實(shí)驗(yàn)采用熱板法和醋酸扭體法綜合考察竹葉柴胡和北柴胡水煎液的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果顯示，竹葉柴胡、北柴胡飲片的水煎液和醇提液在醋酸扭體試驗(yàn)中均有鎮(zhèn)痛作用，兩者的水煎液和醇提液之間無顯著性差異；兩者的水煎液在熱板試驗(yàn)中均顯示出較好的鎮(zhèn)痛作用，而醇提液無明顯作用，提示鎮(zhèn)痛作用的活性成分以水溶性成分居多。

綜合分析表明，2種柴胡不同提取液的藥理作用效果優(yōu)于醇提液，說明柴胡飲片發(fā)揮作用時(shí)除柴胡皂苷外，可能還有柴胡的揮發(fā)油、柴胡多糖以及多種黃酮成分等綜合發(fā)揮作用，說明柴胡采用傳統(tǒng)中藥湯劑的藥用方法具有科學(xué)性；而2種柴胡醇提部分的鎮(zhèn)痛作用可能偏向于外周神經(jīng)作用，其具體作用機(jī)制有待更深一步的研究。本實(shí)驗(yàn)前期對(duì)鄂西北地區(qū)柴胡飲片的資源調(diào)查結(jié)果表明，鄂西北地區(qū)以“北柴胡”之名廣泛使用的柴胡實(shí)際為竹葉柴胡的根，本實(shí)驗(yàn)表明竹葉柴胡與北柴胡解熱鎮(zhèn)痛作用相似，其作用強(qiáng)度沒有顯著性差異，說明竹葉柴胡可以作為北柴胡藥用資源代替使用，這也為開發(fā)新的柴胡飲片資源提供了理論基礎(chǔ)。

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