王啟廣，曹友德，劉 瓊，陳雪初

(湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖南 長(zhǎng)沙410005)

研究表明惡性腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的過(guò)程大致相同，包括原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)、新生血管形成、腫瘤細(xì)胞脫落及血管內(nèi)滲或通過(guò)淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)一步發(fā)展成腫瘤轉(zhuǎn)移灶[1]。 本研究探討胃癌發(fā)病機(jī)制，尋找關(guān)鍵調(diào)控因子，有助于新型高效靶向治療藥物的研發(fā)[2]。

Soncin 和Park 等分別發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因， 命名為VE-statin 和EGFL7[3，4]。 既往研究認(rèn)為EGFL7 具有內(nèi)皮特異性，即只在幼稚的血管內(nèi)皮中表達(dá)[5]，但隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)一些腫瘤細(xì)胞中也有EGFL7 的表達(dá)， 如在肝癌、前列腺癌和惡性膠質(zhì)瘤，且其表達(dá)與腫瘤的臨床病理特征相關(guān)[6，7]。本實(shí)驗(yàn)用免疫組化法檢測(cè)胃癌組織EGFL7 的表達(dá)， 分析其表達(dá)與腫瘤分級(jí)、FⅧ及微血管密度（MVD）的相關(guān)性。為研究其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制提供理論依據(jù)，從而評(píng)價(jià)其對(duì)胃癌細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力的影響，為進(jìn)一步的胃癌靶向治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

收集湖南省人民醫(yī)院2010.1～2011.01 行手術(shù)切除的新鮮胃癌組織45 例 （男性32 例， 女性13例）。 經(jīng)10%福爾馬林固定， 常規(guī)石蠟包埋， 切成4μm 厚的石蠟切片，進(jìn)行SP 免疫組化染色。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

鼠抗人EGFL7 單克隆抗體購(gòu)自上?？ㄅ锕荆舛?：400），鼠抗人即用型FⅧ抗體購(gòu)自福州邁新生物試劑公司，SP-9000 免疫組化染色試劑盒和DAB 染色劑購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

按照鏈霉菌抗生物素一過(guò)氧化物霉(streptavidin-peroxidase, S-P) 法檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別對(duì)胃癌組織中EGFL7 和FⅧ進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果由兩位高年資病理科醫(yī)生進(jìn)行雙盲法閱片。

1.3 結(jié)果判定

參考Eroglu 等的[8，9]IRS ( immuno-reactive score )法即在高倍鏡(×200) 下隨機(jī)選5 個(gè)視野, 每視野計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞, 根據(jù)染色強(qiáng)度、 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)兩者計(jì)分的乘積進(jìn)行判斷:IRS = 陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度×組織細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占的百分比。 陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度記分如下: 未著色記0 分； 淡黃色記1分；黃色記2 分；棕黃色記3 分。組織細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占的百分比判分標(biāo)準(zhǔn)：0%記0 分；1%-10%記1 分；11%-50%記2 分；5l%-80%記3 分；80%-100%記4 分。

EGFL7 表達(dá)強(qiáng)度判定： 綜合評(píng)分0 分為陰性（-），1～4 分為弱陽(yáng)性（+），5～8 分為中度陽(yáng)性（++），9～12 分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

微血管密度( microvessel density , MVD ) 測(cè)定[10]：FⅧ特異性表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，本文以FⅧ抗體標(biāo)記血管，進(jìn)行免疫組化染色。 凡呈現(xiàn)棕黃色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞群者均作1 個(gè)血管計(jì)數(shù), 肌層較厚及管腔直徑大于8 個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管不予計(jì)數(shù)[11]。 在光學(xué)顯微鏡低倍視野下(×100) 掃視整個(gè)切片, 于浸潤(rùn)區(qū)域選取內(nèi)皮細(xì)胞染色清晰、背景對(duì)比良好、微血管數(shù)量最密集的視野以200 倍視野計(jì)數(shù)此區(qū)域微血管數(shù)，分別計(jì)數(shù)3 個(gè)微血管密集區(qū)的微血管數(shù)求其均數(shù)來(lái)表示觀察組織的微血管計(jì)數(shù), 即MVD 。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 計(jì)量資料兩組間均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)， 檢驗(yàn)水平p=0.05； 計(jì)量資料多組間均數(shù)比較采用方差檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平P=0.05。 兩變量的相關(guān)分析采用Pearson 相關(guān)系數(shù)，檢驗(yàn)水平P=0.05。

2 結(jié)果

浸潤(rùn)至漿膜層組EGFL7 陽(yáng)性率為84.4%，顯著高于未浸潤(rùn)至漿膜層組（46.2%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組EGFL7 的陽(yáng)性率為84.6%，顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（57.9%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；EGFL7 的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P<0.05），與分化程度無(wú)關(guān)（P>0.05）(表1,圖1, 2)

低分化胃癌組MVD 均值為37.62±10.42，高于高分化組(27.91±9.93)和中分化組(28.40±9.18)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；浸潤(rùn)至漿膜層組MVD均值為34.25±10.43， 高于未浸潤(rùn)至漿膜層組(26.69±8.66)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組MVD 均值為33.00±9.99， 高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(25.94±9.34)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。MVD 值與腫瘤分化程度、 浸潤(rùn)深度及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05)。 （表2，圖2，3）

EGFL7 表達(dá)陽(yáng)性的胃癌組織中MVD 均值為33.80±10.56，顯著高于其陰性表達(dá)組（26.01 ±7.21）（P<0.05），經(jīng)Pearson 分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中MVD值與EGFL7 的表達(dá)呈正相關(guān) （r=0.313, P=0.049）。（表3，圖4）

表1 胃腺癌中EGFL7 的表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性

表2 胃癌組織中MVD 與臨床病理相關(guān)性分析

表3 胃癌組織中EGFL7 的表達(dá)與MVD 之間的關(guān)系

圖1 正常胃組織中EGFL7 表達(dá)陰性(SP 法，200×)

圖2 胃癌組織中EGFL7 的表達(dá)陽(yáng)性(SP 法，400×)

圖3 FⅧ標(biāo)記胃癌組織中微血管增生(SP 法，400×)

圖4 胃癌組織中MVD 與EGFL7 表達(dá)相關(guān)性散點(diǎn)圖

3 討論

EGFL7 是腫瘤血管生成過(guò)程中一個(gè)新的必不可少的促血管生成因子。 以前的研究認(rèn)為EGFL7的表達(dá)僅限于內(nèi)皮系統(tǒng)[5]，但目前部分研究發(fā)現(xiàn)一些腫瘤細(xì)胞中亦有EGFL7 的表達(dá), 如前列腺癌[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中EGFL7 的表達(dá)陽(yáng)性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)深度呈正相關(guān)（P<0.05）。 同時(shí)，胃癌組織中EGFL7 的表達(dá)程度與MVD 值成正相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EGFL7 的表達(dá)隨著瘤組織浸潤(rùn)層次的加深而增加， 同時(shí)MVD 也是隨著浸潤(rùn)深度的增加而增大；腫瘤性新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞不夠完整，腫瘤細(xì)胞容易通過(guò)其進(jìn)入血管，通過(guò)靜脈-淋巴管吻合處進(jìn)入淋巴循環(huán)，導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)： 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例其EGFL7 的表達(dá)和MVD 值均大于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例， 據(jù)此推測(cè)胃癌組織中EGFL7 的表達(dá)促進(jìn)了腫瘤性血管的新生，促進(jìn)了腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，阻斷或降低EGFL7的表達(dá)，將可能減少腫瘤性血管的新生，從而阻止或延緩腫瘤的進(jìn)展， 為臨床治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

[1] Chambers AF, Groom AC, MacDonald IC. Dissemination and growth of cancer cells in mestastatic sites [J]. Nat Rev Cancer, 2002,2(8):562-572.

[2] 呂偉, 陳凜. 胃癌分子靶向治療的現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].世界華人消化雜志2007, 15(25): 2672-2678.

[3] Soncin F，Mattot V，Lionneton F，et al.VE -statin，an endothelial repressor of smooth muscles cell migration [J].EMBO J，2003，22(21)：5700-5711.

[4] Park LH，Schmidt M，Jin SW，et al.The endothelial-cellderived secreted factor EGFL7 regulates vescular tube formation [J].Nature，2004，428(6984)：754-758.

[5] Campagnolo L，Leahy A，Chitnis S，et al.EGFL7 is a chamoattractant for endothelial cells and is up-regulated in angiogenesis and arterial injury [J].American Journal of Pathology，2005，167(1)：275-284.

[6] Morgenbesser SD, Dufault MR, Martin TS, et al.Characterization of EGFL7 expression and function in tumorigenesis and angiogenesis [C]. Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting, 2005,46:1103.

[7] Huang CH, Li XJ, Zhou YZ, et al. Expression and clinical significance of EGFL7 in malignant glioma. [J]. J Cancer Res Clin Oncol. 2010, 136(11):1737-1743.

[8] Ko CD, Kim JS, Ko BG, et al. The meaning of the c-kit proto -oncogene product in malignant transformation in human mammary epithelium.Clin Exp Metastasis, 2003,20:593-597.

[9] Eroglu A, Sari A. Expression of c-kit proto-oncogene product in breast cancer tissues. Med Oncol, 2007, 24:169-174.

[10]Weidner N, Folkman J, Pozza F, Bevilacqua P, Allred EN,Moore DH, Meli S, Gasparini G (1992) Tumor angiogenesis: a new signiWcant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma. J Natl Cancer Inst 84:1875-1887）.

[11]Weidner N，F(xiàn)olkman J，Pozza F，et al. Tumor angiogenesis:a new significant and independent prognostic indicator in early stage breast carcinoma [J]. J Natl Cancer,1992.84（24）:1875-1887.