易恒仲, 龍靈芝，周源，曹建國，張堅松

（1. 湖南省胸科醫(yī)院, 湖南 長沙, 410013， 2. 湖南師范大學醫(yī)學院，湖南 長沙, 410013 ）

小細胞肺癌約為肺癌總數(shù)的20%～25%， 在初次治療中，對化學治療及放射治療敏感，但極易復發(fā)和發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，迄今小細胞肺癌患者的5年生存率僅為7%[1]。目前通過手術、化療、放療和綜合治療等手段仍無法進一步降低小細胞肺癌的死亡率。腫瘤干細胞( cancerr stem cells，CSCs)的發(fā)現(xiàn)為人們理解腫瘤發(fā)病機制提供了新視野，亦為肺癌的研究和治療提供新的靶點和方式[2]。 耿沁等[3]從肺癌細胞系通過干細胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法得到肺球體細胞中肺癌干細胞高度富集并具有致瘤性。Singh 等[2]研究表明Akt 抑制劑LY294002 具有下調(diào)干細胞標志物SOX2表達和抑制非小細胞肺癌側群細胞自我更新作用。本文用干細胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法從人小細胞肺癌NCI-H446 細胞系富集和擴增肺球體形成細胞即肺癌干細胞樣細胞(lung cancer stem cell like cells, LCSLCs)， 對比觀察LCSLCs 與NCI-H446 細胞系細胞Akt 蛋白磷酸化水平， 同時考察Akt 特異性抑制劑LY294002 對LCSLC 自我更新的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

Akt 抑制劑LY294002 購自美國Sigma 公司。鼠抗人p-Akt (ser473) 和Akt 單克隆抗體為美國Cell signalingg 公司產(chǎn)品；鼠抗人β-actin 單克隆抗體購自美國Sigma 公司

1.2 細胞系與成球培養(yǎng)

人小細胞肺癌NCI-H446 細胞系購自上海中國科學院細胞庫(中國上海市)。 細胞生長于含10%胎牛血清100U/mL 青霉素和100U/mL 鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 收集細胞，洗滌除去血清，然后，再用添加100 IU/mL 青霉素G、100 μg/mL 鏈霉素、20 ng/mL 人重組表皮生長因子、10 ng/mL 人重組堿性成纖維細胞生長因子、2%不含維生素A 的B27 添加物，1% N2添加物(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)的DMEM/F12 培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。 在隨后的懸浮培養(yǎng)中，采用超低粘附6 孔細胞培養(yǎng)板(Corning Inc.,Corning, NY, USA)， 每孔接種細胞數(shù)不超過5000個細胞。

1.3 肺球體細胞傳代培養(yǎng)和腫瘤球形成試驗

低速溫和離心收集源自NCI-H446 細胞系肺癌球形成細胞，然后，用EDTA-胰蛋白酶消化，并用吹打管機械分散細胞。 得到的單細胞懸液，離心除去消化酶，然后，重新懸浮于干細胞條件培養(yǎng)基中用于再次成球試驗。 在球體達到50 μm 直徑大小時傳代(6 天)。 取上述肺球體再次成球細胞，用干細胞條件培養(yǎng)基， 以每毫升2000 個細胞的密度接種于6 孔超低粘附培養(yǎng)板。 將不同濃度的LY294002(5.0、10.0、20.0μM)添加到干細胞條件培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)6 天后， 在Nikon Eclipse TE2000-S顯微鏡下計數(shù)腫瘤細胞球的個數(shù)。

1.4 裸鼠皮下成瘤實驗

取SPF 級突變系雄性Balb/c-nu 小鼠(4 周齡，體重14-18g)12 只，隨機分為3 組，第1 組，低細胞數(shù)組(在裸小鼠的右前肢附近的右側皮下接種人肺癌NCI-H446 細胞系肺癌球形成細胞2000 個/只；在裸小鼠的左前肢附近的左側皮下接種人肺癌NCI-H446 細胞系細胞10000 個/只)×4 只；第2 組，中細胞數(shù)組(在裸小鼠的右前肢附近的右側皮下接種人肺癌NCI-H446 細胞系肺癌球形成細胞10000個/只； 在裸小鼠的左前肢附近的左側皮下接種人肺癌NCI-H446 細胞系細胞100000 個/只)×4 只；第3 組，高細胞數(shù)組(在裸小鼠的右前肢附近的右側皮下接種人肺癌NCI-H446 細胞系肺癌球形成細胞100000 個/只；在裸小鼠的左前肢附近的左側皮下接種人肺癌NCI-H446 細胞系肺癌球形成細胞1000000 個/只)×4 只。 觀察皮下接種部位的成瘤與否以及成瘤時間(潛伏期，最長時間點為2 個月)。

1.5 Western Blot

細胞以PBS 沖洗一遍， 加入1mL 裂解酶緩沖液(50 mM Tris-HCl pH7.4、150 mM NaCl、0.2 mM EDTA、0.2% NP-40、10% 丙三醇、1M β-Me、1 μg/mL 抑肽酶、0.5 μg/mL 抑酶醛肽、0.1 mM Na3VO4、0.5 mM 4NPP、0.5 mM NaF 及蛋白酶抑制劑) 刮取并收集細胞。 細胞裂解液經(jīng)13200 × g、 4°C 條件下離心5 min， 制備全細胞提取物。 Bradford 試驗(Bio-Rad Laboratories, Hercule s, CA)測定蛋白質(zhì)含量。 以10～12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離提取的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。 該膜首先在PBST中以脫脂牛奶5%(w/v)進行封閉，為了進行探針檢測，隨后以標示的一抗孵育，輕微震動下，4°C 條件下過夜。 沖洗膜四次后，以適當?shù)倪^氧化物酶標記的二抗孵育上述PVDF 膜1 h。 以增強化學發(fā)光試劑盒(Amersham Biosciences)對信號進行檢測。

1.6 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)錄入SPSS 15.0 for windows evaluation軟件(SPSS Inc,Chicago,IL)，建立數(shù)據(jù)庫，各組實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(mean±SD) 表示， 用One Way ANOVA 方式行方差分析。 首先進行方差齊性檢驗，當方差齊性時，各組均數(shù)間的兩兩比較用LSD 法，如果方差不齊， 對照組均數(shù)與實驗組均數(shù)間的比較用Dunnett 法，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2. 結果

2.1 人小細胞肺癌NCI-H446 細胞系中LCSCs 的富集與擴增

如圖1 所示， 體外培養(yǎng)和擴增小細胞肺癌NCI-H446 細胞系，以干細胞條件培養(yǎng)基，在超低粘附6 孔細胞培養(yǎng)板中懸浮培養(yǎng)6 天，細胞呈現(xiàn)典型非粘附三維球狀生長(圖1)。 因此，在本研究中，我們定義干細胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)得到的肺球體形成細胞為LCSLCs，并作為后續(xù)實驗的模型。

圖1 小細胞肺癌NCI-H446 細胞系細胞成球培養(yǎng)

2.2 LCSCs 具有高致瘤特性

為了證明人肺癌NCI-H446 細胞系肺球體形成細胞即本文定義的LCSCs 具有更強的體內(nèi)腫瘤形成能力， 我們用不同細胞數(shù)目的人肺癌NCIH446 細胞系細胞和LCSCs 接種Balb/c-nu 免疫缺陷小鼠， 從而得到在體內(nèi)成瘤的最小接種細胞數(shù)。結果表明，10000 個LCSCs 就足夠穩(wěn)定地形成腫瘤，然而，在相應的同一模型下至少1000000 個人肺癌NCI-H446 細胞系細胞才能穩(wěn)定導致腫瘤形成，此外，成瘤的時間長短亦有很大的差別(肺球體形成細胞：23 天；NCI-H446 細胞系細胞：35 天)。 表明LCSCs 具有高致瘤性(表1)。

表1 人肺癌NCI-H446 細胞系細胞和成球細胞在Balb/cnu 免疫缺陷小鼠的異種移植瘤形成能力比較

2.3 LCSCs 組成性活化Akt

Western blot 分析結果顯示： 與相應非分選細胞相比，LCSCs 組成性活化Akt，表現(xiàn)為Akt 高磷酸化水平(圖2)。

圖2 LCSCs 與非分選細胞Akt 磷酸化的比較

用抗p-Akt(ser473)抗體和抗Akt 抗體，進行Western blot 分析，β-actin 作為加樣量對照。UC：非分選細胞；SFC：肺球體形成細胞。

2.4 LY294002 降低LCSCs 的Akt 蛋白磷酸化水平

Western blot 分析結果顯示：Akt 特異性抑制劑LY294002 能有效降低LCSCs 的Akt 蛋白磷酸化水平(圖3)。

圖3 LY294002 對LCSCs 的Akt 蛋白磷酸化水平的影響

不同濃度LY294002(5.0、10.0、20.0 μM)孵 育人肺癌NCI-NCI-H446 細胞系肺球體形成細胞24 h，用抗p-Akt(Ser473)和Akt 抗體進行Western blot分析，β-actin 作為加樣量對照。

2.5 LY294002 抑制LCSCs 自我更新能力

腫瘤球形成試驗的結果表明： 不同濃度LY294002 處理LCSCs 的肺癌球形成數(shù)目顯著降低，成濃度依賴性(表2)。

表2 LY294002 減少肺癌NCI-NCI-H446 細胞系肺癌球形成細胞的肺癌球數(shù)目(Mean±SD, n=3)

3 討論

小細胞肺癌是一種具有很強侵襲性和高轉(zhuǎn)移性的肺癌，約占肺癌病例總數(shù)的20%～25%[1]。此外，小細胞肺癌一般是頑固性的， 治療后極易復發(fā)，這導致其預后極差[1]。 Eramo 等[4]在2007年首次報道了肺癌CSCs 屬于CD133+細胞亞群, 此類CSC 具有球體形成能力, 在免疫缺陷小鼠皮下植入1×104個細胞即能夠形成腫瘤。然而，一些證據(jù)表明：利用CD133 表達的能力區(qū)分肺癌干細胞可能被夸大。例如， 一些CD133 陰性肺癌細胞也具有自我更新能力[5]。 另一種用于鑒別和分選肺癌干細胞的方法是基于醛脫氫酶活性。 從NCI-H358 和NCI-H125 肺癌細胞系分離的ALDH+多數(shù)為高致瘤性的CD133+細胞。 更為重要的是在有限的研究中ALDH1 蛋白表達與病人預后差相關[6]。 然而，還需要進一步的研究確定這些標志物作為假定肺癌干細胞標志物的前景和實用性。惡性實體腫瘤組織中的癌細胞源自上皮細胞，多數(shù)呈貼壁生長，阻止貼壁后癌細胞迅速凋亡，稱為失巢凋亡(anoikis)。人們利用CSC 具有anoikis 抗性， 能在無血清培養(yǎng)條件下， 經(jīng)EGF、FGF 等細胞生長因子誘導形成懸浮生長的細胞球體的方法分離和富集CSCs, 例如腦瘤、乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、前列腺癌和黑素瘤的CSC均具有球體形成能力[7]。耿沁等[3]從人非小細胞肺癌細胞系通過干細胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法得到肺球體細胞中肺癌干細胞高度富集并具有致瘤性。在本文的研究中，我們以干細胞條件培養(yǎng)基，在超低粘附6 孔細胞培養(yǎng)板中得到的肺球體形成細胞亦具有自我更新特性和高致瘤性。說明源自人小細胞肺癌NCI-H446 細胞系肺球體形成細胞具有LCSCs 特性。

Singh 等利用DNA 染料Hoechst 33342 排除法從非小細胞肺癌細胞系分選得到側群(SP)細胞具有LCSCs 特性， 同時發(fā)現(xiàn)SP 細胞較non-SP 細胞更高表達Akt 磷酸化蛋白， 提示：Akt 組成性激活對于維持LCSCs 特性可能有重要意義[2]。 我們采用Wester blot 分析的結果也證實，與親本細胞系細胞相比，源自人小細胞肺癌NCI-H446 細胞系肺球體形成細胞高表達Akt 磷酸化蛋白。說明來自小細胞肺癌的LCSLCs 具有Akt 組成性活化的信號途徑特征， 暗示Akt 組成性活化在維持小細胞肺癌LCSLCs 自我更新中發(fā)揮重要作用。

為了證明Akt 組成性活化在維持小細胞肺癌LCSLCs 自我更新中發(fā)揮重要作用，我們用不同濃度Akt 活性特異性抑制劑LY294002 處理源自人小細胞肺癌NCI-H446 細胞系肺球體形成細胞觀察Akt蛋白磷酸化水平和自我更新能力的變化。 正如預期的那樣，研究結果表明：LY294002 在降低源自人小細胞肺癌NCI-H446 細胞系肺球體形成細胞Akt 蛋白磷酸化水平的同時， 以劑量依賴方式抑制肺癌球形成能力。 從而證實LY294002 具有抑制來自小細胞肺癌的LCSLCs 自我更性作用。 因此，突出了靶向抑制小細胞肺癌LCSCs 中組成性激活Akt 信號傳導是一種抑制小細胞肺癌LCSCs 自我更新功能發(fā)揮治療小細胞肺癌的新策略的科學意義。

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