冷 梅，劉 榮

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

紫葉稠李(Prunus virginiana)又名斑葉稠李，屬薔薇科(Rosaceae)稠李屬(Padus)植物，產(chǎn)于北半球寒溫帶地區(qū)，喜光、耐寒、耐旱性強(qiáng)，具有很強(qiáng)的觀賞性，落葉喬木，花期4～5月，果實(shí)球形，果實(shí)呈紫紅色，果熟期8～9月，味澀微甜紫葉稠李含有豐富的花色苷[1]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)紫葉稠李的研究集中在木苗繁育、葉片成分分析等方面[2]，對(duì)果實(shí)中的天然活性成分和抗氧化略有報(bào)道[3]，而對(duì)于紫葉稠李果實(shí)抗腫瘤的生理活性未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以體外抗氧化和腫瘤細(xì)胞為體系模型，研究紫葉稠李果實(shí)花色苷的含量、體外抗氧化活性、作用于腫瘤細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶和氧化產(chǎn)物的變化，為揭示紫葉稠李的生理功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫葉稠李果實(shí)采自哈爾濱雙環(huán)園林采摘；細(xì)胞株人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞 哈爾濱工業(yè)大學(xué)；三羥甲基氨基甲烷、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國(guó)Sigma公司；胰蛋白酶 天津市灝洋生物制品有限責(zé)任公司；胚胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司；Triton X-100 生興生物技術(shù)(南京)有限公司；青霉素-鏈霉素 碧云天生物技術(shù)研究所；GSH-Px、CAT、SOD、MDA試劑盒 南京建成生物工程研究所；其余所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 紫葉稠李果實(shí)花色苷的提取

將烘干紫葉稠李果實(shí)粉末以料液比1：20(m/V)加入60%乙醇浸提3h→500W超聲30min→離心→提取液抽濾3次→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→回收浸提液→浸提液加入AB-8樹脂→平衡吸附2h→用60%乙醇以2.0mL/min的流速洗脫→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→回收浸提液→凍干[4-7]。

1.2.2 花色苷含量的測(cè)定

采用pH示差法測(cè)定紫葉稠李果實(shí)中花色苷的含量[8]。稀釋提取物分別用0.025mol/L，pH1.0的KCl緩沖液和pH4.5 CH3COONa緩沖液比例混合，分別在515nm和700nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蒸餾水為空白比色。花色苷的含量按照公式(1)計(jì)算。

式中：A為吸光度，A =(A515nm－A700nm)pH1.0－(A515nm－A700nm)pH4.5；Mw為花色苷3-糖配基的分子質(zhì)量(449.2D)；E為花色苷3-糖配基的摩爾吸收系數(shù)(26900L/(mol·cm))；ρ為緩沖液的質(zhì)量濃度/(mg/mL)。每1g粉末中花色苷的含量用3-糖配基的毫克數(shù)表示。

1.2.3 體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9]，依次向試管中加入8.62×10－2mmol/L DPPH乙醇溶液2mL，不同質(zhì)量濃度的樣液2mL，避光混合30min后于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A1；同法操作，用等體積乙醇代替樣液，測(cè)定吸光度A0；不加DPPH溶液，用等體積乙醇代替，加入不同質(zhì)量濃度的樣液，同法操作測(cè)定吸光度A2。每份樣品平行操作3次，按照公式(2)計(jì)算清除率，并計(jì)算半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)。

1.2.3.2 ·OH清除能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10]，依次向試管中加入不同質(zhì)量濃度的樣液1mL，6mmol/L FeSO4溶液2mL，6mmol/L的H2O2溶液2mL，振蕩搖勻，靜置10min，再加入6mmol/L的水楊酸2mL，靜置30min后于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A1；同法操作，用等體積蒸餾水代替樣液，測(cè)定吸光度A0；不加水楊酸，用等體積蒸餾水代替，加入不同質(zhì)量濃度的樣液，同法操作測(cè)定吸光度A2。每份樣品平行操作3次，按照公式(3)計(jì)算清除率，并計(jì)算IC50。

參照文獻(xiàn)[11]，依次向試管中加入不同質(zhì)量濃度的樣液1mL，pH8.2的Tris-HCl緩沖液6mL，37℃水浴10min，再加入37℃預(yù)熱過的7mmol/L的鄰苯三酚鹽酸溶液1mL，混合反應(yīng)4min，用0.5mL濃鹽酸終止反應(yīng)，于325nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A1；同法操作，用等體積蒸餾水代替樣液，測(cè)定吸光度A0；不加pH8.20的Tris-HCl緩沖液，用等體積蒸餾水代替，加入不同質(zhì)量濃度的樣液，同法操作測(cè)定吸光度A2。每份樣品平行操作3次，按照公式(4)計(jì)算清除率，并計(jì)算IC50。

1.2.3.4 過氧化氫清除能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[12]，依次向試管中加入不同濃度的樣液1mL，0.1mol/L的H2O2溶液1mL，質(zhì)量濃度3g/100mL的鉬酸銨溶液0.1mL，2mol/L的H2SO4溶液10mL，1.8mol/L的KI溶液7mL，混合后靜置片刻。將混合液用5mmol/L的Na2S2O3溶液滴定至溶液的黃色消失，測(cè)定V1；同法操作，用等體積蒸餾水代替樣液，測(cè)定V0；不加KI，用等體積蒸餾水代替，加入不同質(zhì)量濃度的樣液，同法操作測(cè)定V2。每份樣品平行操作3次，按照公式(5)計(jì)算清除率，并計(jì)算IC50。

1.2.3.5 總還原能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13]，依次向試管中加入不同質(zhì)量濃度的樣液1mL，0.2mol/L pH6.6的PBS緩沖液2.5mL，質(zhì)量濃度1g/100mL的K3Fe(CN)6溶液2.5mL，混勻后于50℃水浴20min，再加入體積分?jǐn)?shù)為10%的C2HCl3O2溶液2.5mL，振蕩混合后1000r/min離心10min。吸取離心后的上清液5mL于比色管中，依次加入蒸餾水5mL，0.1%的FeCl3·6H2O溶液1mL，混合后于700nm波長(zhǎng)測(cè)定溶液吸光度A1；以蒸餾水代替不同質(zhì)量濃度的樣液，同法操作測(cè)定吸光度A0。每份樣品平行操作3次，按照公式(6)計(jì)算總還原能力，并計(jì)算IC50。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞株和人宮頸癌HeLa細(xì)胞株培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%滅活的胚胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素)，人肝癌HepG2細(xì)胞株培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%滅活的胚胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素)。37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞[14-16]。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、CAT、SOD活性和MDA含量測(cè)定

胰酶消化后，用含10%的胎牛血清培養(yǎng)液稀釋成1.0×105個(gè)/mL，并吹打均勻，接種于24孔板，每孔1000μL，加藥組設(shè)5個(gè)質(zhì)量濃度，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后，分別加入質(zhì)量濃度為0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mg/mL的紫葉稠李果實(shí)花色苷100μL，同時(shí)對(duì)照組加入100μL的培養(yǎng)基，繼續(xù)置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，取藥物作用的細(xì)胞，用PBS洗1遍，加入0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化，制成細(xì)胞懸液，4000r/min離心5min收集細(xì)胞，再用PBS洗1遍，加入細(xì)胞裂解液(150mmol/L NaCl、150mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA、1% Triton X-100 pH 8.0)使細(xì)胞裂解，于4℃離心1h，以上清液作為樣本，參照試劑盒說明書測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、CAT、T-SOD活性和MDA含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 紫葉稠李花色苷含量的測(cè)定

利用花色苷與黃酮的結(jié)構(gòu)特性，當(dāng)pH1.0時(shí)，在510nm波長(zhǎng)處兩者均有最大吸收峰，當(dāng)pH4.5時(shí)，花色苷轉(zhuǎn)化為無色查爾酮形式，在510nm波長(zhǎng)無吸收峰，在700nm波長(zhǎng)處有吸收峰，因此利用pH示差法測(cè)定紫葉稠李花色苷的含量為(0.830±0.033)mg/g。

2.2 體外抗氧化活性的測(cè)定結(jié)果

2.2.1 紫葉稠李果實(shí)花色苷對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖 1 紫葉稠李果實(shí)花色苷清除DPPH自由基的能力Fig.1 DPPH free radical scavenging capacity of the anthocyanins

由圖1可知，紫葉稠李果實(shí)花色苷對(duì)DPPH自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，并成明顯的量效關(guān)系。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，紫葉稠李果實(shí)花色苷清除率比VC低，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.10mg/mL時(shí)，紫葉稠李花色苷的清除率為60.59%，VC的清除率為75.13%，可見紫葉稠果實(shí)李花色苷對(duì)DPPH自由基有一定的清除能力，紫葉稠李果實(shí)花色苷對(duì)DPPH自由基的清除率IC50為0.064mg/mL。

2.2.2 紫葉稠李果實(shí)花色苷對(duì)·OH清除能力

圖 2 紫葉稠李果實(shí)花色苷清除·OH的能力Fig.2 Hydroxyl free radical scavenging capacity of the anthocyanins

由圖2可知，紫葉稠李果實(shí)花色苷對(duì)·OH的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，并成明顯的量效關(guān)系。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，紫葉稠李果實(shí)花色苷清除率比VC低，當(dāng)質(zhì)量濃度為10mg/mL時(shí)，紫葉稠李果實(shí)花色苷的清除率為77.84%，VC的清除率為90.24%，可見紫葉稠李果實(shí)花色苷對(duì)·OH有較強(qiáng)的清除能力，紫葉稠李果實(shí)花色苷對(duì)·OH的清除率IC50為1.320mg/mL。

圖 3 紫葉稠李果實(shí)花色苷清除·的能力Fig.3 Superoxide anion free radical scavenging capacity of the anthocyanins

2.2.4 紫葉稠李果實(shí)花色苷對(duì)H2O2清除能力

由圖4可知，紫葉稠李果實(shí)花色苷對(duì)H2O2的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，并呈明顯的量效關(guān)系。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，紫葉稠李果實(shí)花色苷清除率比VC低，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5mg/mL時(shí)，紫葉稠李果實(shí)花色苷的清除率為78.45%，VC的清除率為93.37%，可見紫葉稠李果實(shí)花色苷對(duì)H2O2有較強(qiáng)的清除能力，紫葉稠李果實(shí)花色苷對(duì)H2O2的清除率IC50為0.244mg/mL。

圖 4 紫葉稠李果實(shí)花色苷清除H2O2的能力Fig.4 H2O2 scavenging capacity of the anthocyanins

2.2.5 紫葉稠李果實(shí)花色苷的總還原能力

圖 5 紫葉稠李果實(shí)花色苷的總還原能力Fig.5 Total reducing power of the anthocyanins

由圖5可知，紫葉稠李果實(shí)花色苷的總還原能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，紫葉稠李果實(shí)花色苷總還原能力比VC低，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.25mg/mL時(shí)，紫葉稠李果實(shí)花色苷的總還原能力為0.547，VC總還原能力為1.789，可見紫葉稠李果實(shí)花色苷的總還原能力較弱。

2.3 細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶/物的檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活性的檢測(cè)結(jié)果

表 1 紫葉稠李果實(shí)花色苷作用72h后3種腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活性Table 1 GSH-Px activity in tumor cells after 72 h treatment with different concentrations of the anthocyanins

由表1可知，紫葉稠李果實(shí)花色苷以質(zhì)量濃度0.3mg/mL作用于HT29、HepG2、HeLa細(xì)胞72h后，3種細(xì)胞內(nèi)GSH-Px的活性即出現(xiàn)下降趨勢(shì)，隨著紫葉稠李果實(shí)花色苷質(zhì)量濃度的增大，GSH-Px的活性逐漸降低。當(dāng)紫葉稠李果實(shí)花色苷的質(zhì)量濃度為0.3mg/mL時(shí)，HT29細(xì)胞與對(duì)照組的差異顯著，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.3mg/mL時(shí)，HT29細(xì)胞與對(duì)照組的差異極顯著；當(dāng)紫葉稠李果實(shí)花色苷的質(zhì)量濃度大于0.3mg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞與對(duì)照組的差異極顯著；當(dāng)紫葉稠李果實(shí)花色苷的質(zhì)量濃度為0.3mg/mL時(shí)，HeLa細(xì)胞與對(duì)照組的差異顯著，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.3mg/mL時(shí)，HeLa細(xì)胞與對(duì)照組的差異極顯著。

2.3.2 細(xì)胞內(nèi)CAT活性的檢測(cè)結(jié)果

表 2 紫葉稠李果實(shí)花色苷作用72h后3種腫瘤細(xì)胞內(nèi)CAT活性Table 2 CAT activity in tumor cells after 72 h treatment with different concentrations of the anthocyanins

由表2可知，紫葉稠李果實(shí)花色苷以質(zhì)量濃度0.3mg/mL作用于HT29、HepG2、HeLa細(xì)胞72h后，3種細(xì)胞內(nèi)CAT的活性即出現(xiàn)下降趨勢(shì)，隨著紫葉稠李果實(shí)花色苷質(zhì)量濃度的增大，CAT的活性逐漸降低。當(dāng)紫葉稠李果實(shí)花色苷的質(zhì)量濃度為0.6mg/mL時(shí)，HT29細(xì)胞與對(duì)照組的差異顯著，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.6mg/mL時(shí)，HT29細(xì)胞與對(duì)照組的差異極顯著；當(dāng)紫葉稠李果實(shí)花色苷的質(zhì)量濃度大于等于0.3mg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞與對(duì)照組的差異極顯著；當(dāng)紫葉稠李果實(shí)花色苷的質(zhì)量濃度大于等于0.3mg/mL時(shí)，HeLa細(xì)胞與對(duì)照組的差異極顯著。

2.3.3 細(xì)胞內(nèi)T-SOD活性的檢測(cè)結(jié)果

表 3 紫葉稠李果實(shí)花色苷作用72h后3種腫瘤細(xì)胞內(nèi)T-SOD活性Table 3 T-SOD activity in tumor cells after 72 h treatment with different concentrations of the anthocyanins

由表3可知，紫葉稠李果實(shí)花色苷以質(zhì)量濃度0.3mg/mL作用于HT29、HepG2、HeLa細(xì)胞72h后，3種細(xì)胞內(nèi)T-SOD的活性即出現(xiàn)下降趨勢(shì)，隨著紫葉稠李果實(shí)花色苷質(zhì)量濃度的增大，T-SOD的活性逐漸降低。當(dāng)紫葉稠李果實(shí)花色苷的質(zhì)量濃度為0.3mg/mL時(shí)，HT29細(xì)胞與對(duì)照組的差異顯著，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.3mg/mL時(shí)，HT29細(xì)胞與對(duì)照組的差異極顯著；當(dāng)紫葉稠李果實(shí)花色苷的質(zhì)量濃度為0.3mg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞與對(duì)照組的差異顯著，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.3mg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞與對(duì)照組的差異極顯著；當(dāng)紫葉稠李果實(shí)花色苷的質(zhì)量濃度大于等于0.3mg/mL時(shí)，HeLa細(xì)胞與對(duì)照組的差異極顯著。

2.3.4 細(xì)胞內(nèi)MDA含量的檢測(cè)結(jié)果

由表4可知，紫葉稠李果實(shí)花色苷以質(zhì)量濃度0.3mg/mL作用于HT29、HepG2、HeLa細(xì)胞72h后，3種細(xì)胞內(nèi)MDA的含量即出現(xiàn)上升趨勢(shì)，隨著紫葉稠李果實(shí)花色苷質(zhì)量濃度的增大，MDA的含量逐漸升高。當(dāng)紫葉稠李果實(shí)花色苷的質(zhì)量濃度為0.6mg/mL和0.9mg/mL時(shí)，HT29細(xì)胞與對(duì)照組的差異顯著，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.9mg/mL時(shí)，HT29細(xì)胞與對(duì)照組的差異極顯著；當(dāng)紫葉稠李果實(shí)花色苷的質(zhì)量濃度為0.6mg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞與對(duì)照組的差異顯著，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.6mg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞與對(duì)照組的差異極顯著；當(dāng)紫葉稠李果實(shí)花色苷的質(zhì)量濃度為0.6mg/mL時(shí)，HeLa細(xì)胞與對(duì)照組的差異顯著，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.6mg/mL時(shí)，HeLa細(xì)胞與對(duì)照組的差異極顯著。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定紫葉稠李果實(shí)李花色苷清除DPPH自由基、·OH、·、H2O2和總還原能力，并與VC對(duì)照來評(píng)價(jià)紫葉稠李果實(shí)花色苷的體外抗氧化能力，實(shí)驗(yàn)證明了紫葉稠李果實(shí)花色苷的體外抗氧化能力沒有VC強(qiáng)，但在一定質(zhì)量濃度條件下，對(duì)自由基的清除率都大于60%，仍然是一種較好的抗氧化劑。本實(shí)驗(yàn)還表明紫葉稠李果實(shí)花色苷作用于人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞72h后，GSH-Px、CAT、T-SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高。說明腫瘤細(xì)胞容易受到氧自由基和具有細(xì)胞毒性的MDA的損傷[17-18]。并且細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、CAT、T-SOD活性和MDA含量變化與紫葉稠李果實(shí)花色苷存在質(zhì)量濃度依賴關(guān)系。以上結(jié)果表明，抗氧化能力強(qiáng)的物質(zhì)可清除細(xì)胞內(nèi)的自由基，由于細(xì)胞內(nèi)的自由基下降達(dá)不到平衡，導(dǎo)致抗氧化酶的活性下降，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的含量上升，這可能就引起了腫瘤細(xì)胞的死亡[19-21]。紫葉稠李果實(shí)花色苷對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性和氧化產(chǎn)物含量有影響，但紫葉稠李果實(shí)花色苷的質(zhì)量濃度在什么范圍內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞抗氧化酶活性和氧化產(chǎn)物含量的影響最大，以及對(duì)正常細(xì)胞的影響如何還有待進(jìn)一步研究。

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