呂 樂，杜 靜，閆 海

（1.北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100083；2.北京石油學(xué)院附屬中學(xué)，北京 100083）

微生物學(xué)是研究微生物及其生命活動規(guī)律的科學(xué)，它既是生命科學(xué)中的獨立學(xué)科，又是分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和基因工程學(xué)等現(xiàn)代生物技術(shù)的重要基礎(chǔ)［1－2］。微生物學(xué)實驗是微生物學(xué)課程中的重要組成部分，是學(xué)生理解和掌握微生物學(xué)基本原理的必需的教學(xué)環(huán)節(jié)，在“知識、技能、創(chuàng)新、素質(zhì)”的培養(yǎng)方面具有理論教學(xué)不可取代的作用。掌握微生物實驗技術(shù)對培養(yǎng)學(xué)生的基礎(chǔ)實驗技能，鍛煉學(xué)生觀察能力、操作能力、思維能力與運用知識的能力以及提高學(xué)生動手能力和創(chuàng)新意識有著重要作用［3－4］。因此，我們在教學(xué)過程中注重理論和實踐的結(jié)合，不斷在教學(xué)內(nèi)容上進行改革，以培養(yǎng)順應(yīng)時代發(fā)展的實用型和創(chuàng)新型人才。

近年來，針對傳統(tǒng)微生物實驗教學(xué)體系存在的諸多不足，許多高校都在對微生物學(xué)實驗教學(xué)模式進行著積極的探索，嘗試著在實驗內(nèi)容、教學(xué)模式和教學(xué)方法等方面進行著改革，取得了較好的教學(xué)效果。我們認為突出生物技術(shù)專業(yè)特色，充分利用實驗教學(xué)的特點，提高學(xué)生解決實際問題的能力，加強學(xué)生實踐能力和創(chuàng)新意識的培養(yǎng)是微生物實驗教學(xué)必須遵循的宗旨。結(jié)合本專業(yè)特點和當(dāng)前社會的熱點問題——節(jié)能減排與可持續(xù)發(fā)展，我們有針對性地開展了微生物學(xué)創(chuàng)新性實驗［5－9］項目的探索——構(gòu)建高效處理稀土廢水并固定CO2的新型組合式光生物反應(yīng)器的研究。

1 實驗?zāi)康?、基本原理和材?/h2>

（1）實驗?zāi)康?觀察并掌握小球藻菌落特征、個體形態(tài)、生長及繁殖方式，學(xué)習(xí)并掌握血球計數(shù)板直接計數(shù)法計數(shù)小球藻細胞數(shù)目；掌握培養(yǎng)基的配制原理、配制程序、配制方法及高壓蒸汽滅菌的原理和操作方法；了解環(huán)境因素對小球藻生長的影響，掌握小球藻優(yōu)化培養(yǎng)的方法；根據(jù)實驗要求，查閱國內(nèi)外文獻，設(shè)計并構(gòu)建能高效處理稀土廢水和固定CO2的新型組合式光生物反應(yīng)器，學(xué)習(xí)并掌握TOC－TN 測定儀的原理和使用方法。

（2）基本原理:參考錢存柔、黃儀秀主編，北京大學(xué)出版社出版的《微生物學(xué)實驗教程》［10］。

（3）實驗儀器和材料:小球藻，組合式光生物反應(yīng)器，微生物實驗室各種常用藥品和儀器。

2 實驗內(nèi)容

學(xué)生根據(jù)文獻配制培養(yǎng)基，分離、純化獲得小球藻單克隆菌落，觀察小球藻個體形態(tài)及其菌落特征；在小球藻批量培養(yǎng)實驗中探索稀土廢水濃度對小球藻生長的影響，建立吸光度與藻細胞個數(shù)（干重）之間的線性關(guān)系；設(shè)計并構(gòu)建新型光生物反應(yīng)器，并探索小球藻處理稀土廢水和固定CO2的能力。

3 實驗過程與結(jié)果

3.1 小球藻培養(yǎng)基的制備

實驗所用小球藻來源于北京科技大學(xué)生物科學(xué)與工程系，該藻種具有自養(yǎng)生長和異養(yǎng)生長的能力。學(xué)生查閱文獻，與任課教師討論修改后確定小球藻光照自養(yǎng)培養(yǎng)基、異養(yǎng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。

3.2 小球藻形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及計數(shù)

學(xué)生配制小球藻光照自養(yǎng)培養(yǎng)基，采用平板涂布法從小球藻菌液中分離純化得到小球藻單克隆菌落，觀察個體形態(tài)和菌落特征，并使用血球計數(shù)板對小球藻進行計數(shù)。小球藻個體形態(tài)觀察結(jié)果見圖1。

圖1 小球藻的細胞形態(tài)

3.3 變廢為寶，以稀土廢水培養(yǎng)小球藻

稀土廢水是稀土冶煉過程中排放的廢水，其中氯化銨的質(zhì)量濃度一般高達11 000 mg／L 以上；高氨氮濃度的廢水是引起水體富營養(yǎng)化的重要因素之一。目前，國內(nèi)外處理氨氮廢水的方法主要分為物化法和生物法［11］。由于稀土廢水含氮量高而碳含量不足，因此廢水的可生化性差，氨氮去除率低。微細藻類是最古老的光合作用有機體，不僅可以固定大氣中的二氧化碳，而且可以吸收水體中的氮源支持其生長，同時培養(yǎng)出來的高脂含量的藻細胞可以用來生產(chǎn)生物柴油，高蛋白的藻細胞還可以作為優(yōu)質(zhì)飼料或肥料，因此是解決含氮廢水處理與資源化的一條有效途徑。

根據(jù)微生物學(xué)實驗課的學(xué)時和進度安排，將學(xué)生分為4組，分別探索稀土廢水質(zhì)量分數(shù)為0.1%、1%、5%、10%對小球藻異養(yǎng)生長的影響。具體的實驗方案:將高濃度的稀土廢水按比例稀釋，向其中添加其他營養(yǎng)成分（葡萄糖、磷酸鹽等），經(jīng)121℃的高溫滅菌后作為培養(yǎng)基。每組均按照接種后光密度OD680nm為1.0的接種量接種，在200r／min、25 ℃下黑暗異養(yǎng)培養(yǎng)，并通過測定生物量（680nm 處光密度值）（見圖2和圖3），圖3中DWC 表示干燥后質(zhì)量濃度。凱氏定氮法和TOC－TN 測定儀測定培養(yǎng)液中氨氮（即廢水中氨氮）的利用情況（見圖4），研究其對不同濃度稀土廢水處理能力。

圖2 光密度與小球藻細胞濃度（干燥后質(zhì)量濃度）的線性關(guān)系

圖3 稀土廢水濃度對小球藻生長的影響

3.4 設(shè)計制作新型組合式光生物反應(yīng)器

圖4 小球藻對不同質(zhì)量稀土廢水處理效果

目前，國內(nèi)外微藻光反應(yīng)器主要有開放式和密閉式光生物反應(yīng)器兩大類。開放式光生物反應(yīng)器即開放池培養(yǎng)系統(tǒng)，其優(yōu)點是構(gòu)建簡單、成本低廉及操作簡便，易于放大，最早應(yīng)用于商業(yè)化微藻大規(guī)模培養(yǎng)中。然而該法培養(yǎng)過程受光照、溫度等自然環(huán)境影響較大，并且易被雜菌和其他藻種污染，同時水分蒸發(fā)嚴重，CO2固定效率低，最終導(dǎo)致培養(yǎng)的藻細胞密度低、采收成本較高。密閉式光生物反應(yīng)器是用透明材料組建的一類密閉式生物反應(yīng)器［12］，其比表面積大，光能利用率高，在最佳狀態(tài)下可達到18%，而植物和森林僅能利用入射光能的0.2%。針對開放式反應(yīng)池光能和CO2利用率低、培養(yǎng)環(huán)境不穩(wěn)定等問題，結(jié)合管道式光生物反應(yīng)器光照充分，CO2利用效率高，可以獲得更高的藻生物量的優(yōu)勢，設(shè)計制做出了一種新型組合式光生物反應(yīng)器。該反應(yīng)器同時具備了當(dāng)前培養(yǎng)池和管道式光生物反應(yīng)器的優(yōu)點，不僅能夠高效利用光能和固定二氧化碳，而且可以明顯提高微藻的生長速度，在高效減排CO2和培養(yǎng)大量高細胞濃度微藻方面具有重要的應(yīng)用價值。

3.4.1 設(shè)計思路

本設(shè)計旨在提高光能和CO2的利用效率及微藻的高效生長，因此高效的光生物反應(yīng)裝置需要滿足以下條件:（1）充足可控的光照強度；（2）適宜微藻生長的溫度；（3）pH 控制系統(tǒng)；（4）高效的供氣和布氣裝置；（5）充分而均勻的混合條件。

3.4.2 設(shè)計方案

依據(jù)設(shè)計思路，新型組合式光生物反應(yīng)器包括隔板反應(yīng)池和螺旋管道兩部分。在隔板式反應(yīng)池中實現(xiàn)培養(yǎng)物充分混合、O2的釋放以及適宜溫度、pH 等微藻培養(yǎng)條件的控制；在培養(yǎng)管道中進一步提高微藻光合作用效率和CO2的固定能力，從而達到高效固定CO2和高效培養(yǎng)微藻的目的。

3.4.3 工作原理

本裝置主要由隔板反應(yīng)池和螺旋培養(yǎng)管道兩部分組成，總?cè)莘e28L，培養(yǎng)體積21L（見圖5）。隔板反應(yīng)池主要由微孔曝氣管、溫控裝置和潛水泵組成。微藻培養(yǎng)物在反應(yīng)池中經(jīng)微孔曝氣、pH 值和溫度調(diào)節(jié)、在隔板反應(yīng)池中實現(xiàn)混合流動、O2釋放及培養(yǎng)條件的控制，實現(xiàn)微藻的快速生長；潛水泵將混合后的微藻培養(yǎng)物從培養(yǎng)池中泵入螺旋管道，同時通入CO2使其與微藻在管道中充分進行光合作用，從而完成CO2的高效固定。從螺旋管道流出的培養(yǎng)物再次進入隔板反應(yīng)池實現(xiàn)循環(huán)。由此構(gòu)成隔板反應(yīng)池和螺旋管道組合的節(jié)能固碳微藻培養(yǎng)系統(tǒng)，在高效固定CO2和高效培養(yǎng)微藻方面具有重要的應(yīng)用前景。

圖5 新型組合式光生物反應(yīng)器

3.5 節(jié)能減排，新型光生物反應(yīng)器處理稀土廢水固定CO2的效果

學(xué)生運用自制的新型光生物反應(yīng)器，研究小球藻在光生物反應(yīng)器中處理稀土廢水并固定CO2的效果，并對其進行優(yōu)化。將異養(yǎng)培養(yǎng)獲得的高細胞濃度小球藻液，按照接種后OD680nm為1.0的接種量接種到自制的新型組合式光生物反應(yīng)器中。培養(yǎng)體積為20L，培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)周期為6d。培養(yǎng)過程中通過pH計監(jiān)測培養(yǎng)體系pH 變化，通過蠕加泵流加酸堿控制pH 在6.5左右。CO2濃度采用SCY－2A 二氧化碳氣體測定儀進行測定，CO2固定效率通過測定進氣和出氣中的CO2濃度進行計算。每24h進行CO2的測定，并取樣進行藻細胞濃度的測定。實驗結(jié)束后測定各個樣品并進行分析。結(jié)果表明:稀土廢水含量為1%、小球藻接種后OD680nm為1.0、運行新型組合式光生物反應(yīng)器6d，小球藻生長狀況最好，此時稀土廢水中氨氮去除率和CO2的固定率均可達80%，實現(xiàn)了節(jié)能減排、高效去除氨氮并固定CO2的目標。

4 效果

本創(chuàng)新實驗采用既能光照自養(yǎng)生長又能異養(yǎng)生長的小球藻USTB－01，學(xué)生在批量培養(yǎng)實驗中探索稀土廢水不同質(zhì)量分數(shù)對小球藻異養(yǎng)生長的影響，在此實驗中使學(xué)生初步掌握微生物優(yōu)化培養(yǎng)的方法，熟練使用顯微鏡、分光光度計、凱氏定氮儀和TOC－TN 儀等儀器，能夠分析實驗結(jié)果并建立各數(shù)據(jù)之間的線性關(guān)系。學(xué)生通過查閱文獻，集思廣益，共同設(shè)計并成功構(gòu)建了組合式新型光生物反應(yīng)器，研制的新型組合式微藻光生物反應(yīng)器能夠有效地利用光源，與其他光生物反應(yīng)器相比具有更大的優(yōu)勢，能夠更高效固定CO2，培養(yǎng)獲得高濃度小球藻。通過小球藻培養(yǎng)處理廢水和廢氣，在降低處理成本的同時獲得較高的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益，達到了“變廢為寶”、“節(jié)能減排”的目的，因此利用小球藻處理污水，同時利用太陽光能進行光合作用固定CO2具有很高的應(yīng)用前景。

學(xué)生自主設(shè)計、教師指導(dǎo)的微生物學(xué)設(shè)計性實驗——高效處理稀土廢水并固定CO2的組合式光生物反應(yīng)器研究內(nèi)容貼近生產(chǎn)、生活實際和研究熱點，具有一定的基礎(chǔ)性和探究性［12］。實驗由教師指定實驗范圍，學(xué)生查閱資料，自主設(shè)計實驗方案、準備實驗材料、自己動手完成實驗、觀察分析實驗結(jié)果，并解決實驗中出現(xiàn)的問題，最后撰寫出規(guī)范的實驗報告。學(xué)生在實驗過程中不僅對微生物學(xué)的基本實驗操作進行了反復(fù)訓(xùn)練和強化，規(guī)范了實驗操作，而且通過親自查閱文獻，分析討論實驗中遇到的各種問題，設(shè)計并制作組合式光生物反應(yīng)器，激發(fā)了學(xué)生探索研究的興趣，培養(yǎng)了學(xué)生獨立的思維能力、嚴謹?shù)目茖W(xué)態(tài)度、百折不撓的工作作風(fēng)、相互協(xié)作的團隊精神和勇于開拓的創(chuàng)新意識。實驗中教師充當(dāng)引導(dǎo)者、指導(dǎo)者、監(jiān)督者和服務(wù)者的角色，在引導(dǎo)學(xué)生制定切實可行的實驗方案、聽取學(xué)生匯報實驗進程中，啟發(fā)學(xué)生解決實驗問題等，為學(xué)生服務(wù)［13－15］。

5 結(jié)束語

雖然開設(shè)微生物學(xué)設(shè)計性實驗對于培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力和實踐能力的優(yōu)勢明顯，但在實驗過程中也存在一些問題［16－17］，如實驗時間如何安排更合理、實驗如何安排能達到最好的實驗效果等。我們的微生物學(xué)實驗教學(xué)改革才起步，如何使微生物學(xué)實驗教學(xué)更加適應(yīng)高等教育人才培養(yǎng)的要求，培養(yǎng)出更多更好的創(chuàng)新型人才，我們將不斷地探索和實踐。

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