孫崇臻，王 超，蔡子哲，陳沿廷，吳希陽(yáng)*

(暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632)

蜂蜜是指蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[1]。根據(jù)蜜源植物種類的不同，蜂蜜可以分為單花蜜及混合蜜(又稱雜花蜜)[1]。蜂蜜中除了含有葡萄糖、果糖等糖類物質(zhì)外，還含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分及黃酮酚酸等生物活性物質(zhì)[2]。

不同種類的蜂蜜其化學(xué)成分不同，利用對(duì)蜂蜜化學(xué)成分的分析來(lái)判斷蜂蜜植物來(lái)源及地理來(lái)源已成為一種研究方向[3]。目前國(guó)外相關(guān)研究較多，尤其是對(duì)微量活性物質(zhì)黃酮酚酸及植物激素脫落酸的研究。Federico等[3]對(duì)葡萄牙產(chǎn)的22種單花蜜進(jìn)行脫落酸的研究，確定脫落酸為石楠花蜜的主要成分，并將其用于單花蜜的蜜源判斷。Lihu等[4]研究了9種桉樹(shù)蜜的脫落酸及酚酸，得出紅樹(shù)蜜中脫落酸含量最高，將脫落酸作為桉樹(shù)蜜地理來(lái)源的判別物，同時(shí)沒(méi)食子酸、鞣花酸、肉桂酸作為澳大利亞桉樹(shù)蜜的標(biāo)志物。Lsabel等[5-6]利用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)技術(shù)分析了突尼斯蜂蜜中的酚類物質(zhì)，確定了坎菲醇與8-氧基-坎菲醇為迷迭香蜜的標(biāo)志化合物，同時(shí)從澳大利亞產(chǎn)的小桉樹(shù)蜜中鑒定出毛地黃黃酮與五羥黃酮，并證明它們可以作為不同種類桉樹(shù)蜜的標(biāo)志物。Francisco等[7]用HPLC法對(duì)52種單花蜜進(jìn)行多酚的測(cè)定，在石楠蜜中發(fā)現(xiàn)了脫落酸、鞣花酸；在栗樹(shù)蜜、向日葵蜜、薰衣草蜜中發(fā)現(xiàn)了香豆酸、肉桂酸、阿魏酸等酚酸物質(zhì)。

李菁等[8]對(duì)陜西省不同地區(qū)的8種刺槐蜜的酚酸類物質(zhì)進(jìn)行了研究。郭夏麗等[9]采用HPLC技術(shù)，分析了洋槐蜜、棗花蜜等7種蜂蜜中的23種多酚物質(zhì)，并對(duì)其抗氧化性進(jìn)行研究。

本研究利用HPLC-二極管矩陣檢測(cè)器(photo diode array，PDA)色譜技術(shù)對(duì)枇杷蜜、棗花蜜等8種蜂蜜中的脫落酸和14種多酚進(jìn)行了測(cè)定，為單花蜜的蜜種識(shí)別及其質(zhì)量監(jiān)測(cè)提供依據(jù)，其中龍眼蜜、荔枝蜜、枇杷蜜為南方特有蜜種，目前國(guó)內(nèi)對(duì)這3種蜜的研究較少，對(duì)其進(jìn)行研究在一定程度上擴(kuò)大了檢測(cè)蜜種的范圍。同時(shí)，多酚物質(zhì)的檢測(cè)為蜂蜜的活性成分分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集了2011年4～8月生產(chǎn)的8種蜂蜜，荔枝蜜(廣東廣州)、龍眼蜜(廣東廣州)、枇杷蜜(廣東廣州)、椴樹(shù)蜜(福建福州)、棗花蜜(江西永豐)、益母草蜜(廣西柳州)、野桂花蜜(廣西柳州)、紫云英蜜(上海奉賢)。所有樣品均置于4℃冰箱保存。

1.2 試劑

槲皮素、蘆丁、3,4-二甲氧基肉桂酸、原兒茶酸、Amberlite XAD-2吸附樹(shù)脂 美國(guó)Sigma公司；咖啡酸、α-兒茶酸、p-香豆酸、阿魏酸、柚皮素、木犀草素、山奈酚、芹菜素 成都生物技術(shù)有限公司；脫落酸、楊梅素 上海佳和生物科技有限公司。甲醇(色譜純) 霍尼韋爾中國(guó)有限公司；乙醚、甲酸為分析純；水為超純水、蒸餾水兩種。

1.3 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀(配有SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器及CLASS-VP工作站) 日本島津公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；ZFQ-85A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海醫(yī)械專機(jī)廠；B-260型恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠。

1.4 色譜條件

色譜柱：SHIM-PACK VP-ODS C18(150mm× 4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：100%甲醇-5%甲酸溶液(5：95)；流速：0.8mL/min；進(jìn)樣量：20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：256、285、320nm；進(jìn)行洗脫梯度。

1.5 蜂蜜多酚物質(zhì)的提取

在Lihu等[10]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，具體步驟如下：取100g蜂蜜樣品溶于500mL鹽酸溶液(pH2)中，室溫下磁力攪拌3min，溶解均勻后通過(guò)濾棉除去溶液中的固體顆粒。濾液與150g Amberlite XAD-2(孔徑9nm，粒度0.3～1.2mm)樹(shù)脂混合，磁力攪拌10min，使多酚物質(zhì)被充分吸附。將樹(shù)脂顆粒裝入玻璃柱(55cm×3.0cm)中，用250mL鹽酸溶液(pH2)沖洗柱子，之后用300mL蒸餾水漂洗柱子以除去全部糖類物質(zhì)及其他雜質(zhì)。用400mL甲醇將酚類物質(zhì)洗出，并將洗脫液在45℃真空旋轉(zhuǎn)蒸干(100r/min)，殘留物用5mL水溶解，再用15mL乙醚分3次萃取。醚提取物混合后在30℃條件下去除乙醚，干渣用1mL甲醇復(fù)溶，0.45μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10mg置于10mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并置于4℃冰箱中避光保存，其他質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品由儲(chǔ)備液稀釋得到。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

將15種標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液配制成100μg/mL的單標(biāo)工作液，分別在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得出各對(duì)照品的紫外吸收峰，主要集中在256、280、285、320、360nm五個(gè)波長(zhǎng)。在這5個(gè)波長(zhǎng)下對(duì)75μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在256、285nm及320nm波長(zhǎng)處的出峰數(shù)及分離效果最好，干擾最小，故選擇這3個(gè)波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 梯度洗脫條件的選擇

圖 1 256nm波長(zhǎng)條件下兩種流動(dòng)相的標(biāo)準(zhǔn)品圖譜對(duì)比Fig.1 Comparison of chromatograms of 15 standards at 256 nm with mobile phases A and B

參考陳濱等[11]的洗脫條件，考察甲醇-0.1%甲酸、甲醇-5%甲酸、5%甲酸甲醇-5%甲酸對(duì)15種混合標(biāo)準(zhǔn)品的分離情況。在35℃柱溫條件下，以0.8mL/min的流速進(jìn)樣20μL，對(duì)3種流動(dòng)相進(jìn)行選擇，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%的甲酸不能將15種物質(zhì)完全分離，僅能分離出12種物質(zhì)；甲醇-5%的甲酸、5%甲酸甲醇-5%甲酸均可以使15種混合標(biāo)準(zhǔn)品完全分離，且峰形較好，考慮到柱子對(duì)酸的耐受程度，最終選擇甲醇-5%甲酸作為流動(dòng)相(圖1)。

采用陳濱等[11]的洗脫條件進(jìn)行洗脫，雖然可以使混合標(biāo)準(zhǔn)品得到較好分離，但是對(duì)蜂蜜樣品的分離不是特別理想，多酚物質(zhì)的保留時(shí)間短，于是對(duì)洗脫時(shí)間及流動(dòng)相比例進(jìn)行調(diào)整，確定洗脫梯度為時(shí)間0～6min時(shí)，對(duì)應(yīng)甲醇體積分?jǐn)?shù)2%～8%；6～10min，8%～15%；10～20min，15%～17%；20～30min，17%～32%；30～60min，32%～42%；60～70min，42%～50%；70～71min，50%～100%；72～7 7 m i n 用以平衡色譜柱，對(duì)應(yīng)甲醇體積分?jǐn)?shù)2%。

2.1.3 流速的選擇

對(duì)0.5、0.8、1.0mL/min三個(gè)流速進(jìn)行考察對(duì)比，發(fā)現(xiàn)0.5mL/min時(shí)，樣品保留時(shí)間較長(zhǎng)，1.0mL/min時(shí)壓力比較大，綜合考慮后確定0.8mL/min作為最終流速。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別取儲(chǔ)備液適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為230、150、110、76.38、60、20、5、2.5μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1節(jié)所確定的色譜條件進(jìn)樣分析，平行測(cè)定3次，以標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo)，以平均峰面積為縱坐標(biāo)得到15條標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)。

表 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與相關(guān)系數(shù)Table 1 Standard curves with correlation coefficients

從表1可見(jiàn)，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，表明在此質(zhì)量范圍內(nèi)，各對(duì)照品質(zhì)量濃度與峰面積相關(guān)性良好。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為76.38μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)進(jìn)樣6次，求得各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD在0.18%～1.45%之間，相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.09%～1.04%之間，色譜峰的個(gè)數(shù)及特征沒(méi)有明顯變化，精密度較好。

2.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取野桂花蜜100g，加入0.5mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后按1.5節(jié)的樣品處理方法進(jìn)行處理，并在1.4節(jié)的色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣3次，測(cè)得回收率見(jiàn)表2。由表2可知，荔枝蜜中15種物質(zhì)的加標(biāo)回收率在92.4%～102.1%之間，說(shuō)明本方法回收率較好。

表 2 野桂花蜜的加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果Table 2 Recovery rates of osmanthus honey

2.5 樣品測(cè)定

根據(jù)前述的1.5節(jié)樣品提取條件及1.4節(jié)色譜條件，對(duì)8種蜂蜜樣品中的脫落酸及14種多酚進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2及表3。

圖 2 4種蜂蜜在256、320nm的圖譜對(duì)比Fig.2 Chromatograms of four honey samples at 256 nm and 320 nm

由圖2可知，不同蜂蜜在同一波長(zhǎng)下所得圖譜差別較大，其中野桂花蜜最為明顯，除未知物G1外，其他物質(zhì)峰值均較低；不同蜂蜜酚酸黃酮的分布不同，野桂花蜜出峰時(shí)間集中在30～55min，酚酸物質(zhì)較少；枇杷蜜中黃酮酚酸種類較多，含有未知物G3、G4，分別在320nm及340nm有最大吸收，其中G2為混合物；棗花蜜中各物質(zhì)分布比較均勻，其中F1峰值較大。對(duì)比棗花蜜、荔枝蜜可知，荔枝蜜中各物質(zhì)吸收峰相對(duì)均較高，楊梅酮和脫落酸最為明顯。

表 3 8種蜂蜜樣品中脫落酸及14種多酚測(cè)定結(jié)果Table 3 Contents of flavonoids, phenolic acids and abscisic acid in honeys

由表3可知，不同蜂蜜所含的15種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量差別較大，枇杷蜜中α-兒茶素含量最高，楊梅酮次之；棗花蜜中阿魏酸、楊梅酮含量較高；椴樹(shù)蜜中槲皮素最多，荔枝蜜中脫落酸最多；益母草蜜、野桂花蜜、紫云英蜜均含有較多的原兒茶酸；龍眼蜜中含有較多的阿魏酸、木犀草素，這與郭夏麗等[9]的結(jié)論一致。

同一種物質(zhì)在不同蜂蜜中的含量差別也很大，就脫落酸而言，荔枝蜜、龍眼蜜中脫落酸含量最高，遠(yuǎn)高于其他蜜種，并均高于自身總酚酸含量；就酚酸而言，原兒茶酸與p-香豆酸分布相對(duì)比較均勻，而阿魏酸含量差別較大，在棗花蜜、荔枝蜜中最高，在野桂花蜜、紫云英蜜中含量較少；咖啡酸、沒(méi)食子酸在8種蜂蜜中含量均較低；就黃酮而言，8種蜂蜜中楊梅酮及槲皮素含量相對(duì)較高，芹菜素、山奈酚的含量則較低，其中楊梅酮、槲皮素在荔枝蜜中含量最大，蘆丁及木犀草素在龍眼蜜中最多；芹菜素在益母草蜜、紫云英蜜及野桂花蜜中未被檢出。

由表3可知，不同蜜種總酚的含量差異較大，總酚酸總黃酮的比例分布也不同。荔枝蜜、龍眼蜜的總酚含量最高，均大于2000μg/100g蜂蜜，而野桂花蜜、椴樹(shù)蜜的總酚含量則較低；龍眼蜜的總酚酸含量最高，占其總酚含量的28%，而荔枝蜜、龍眼蜜則含有最多的黃酮，分別占其總酚含量的80%、71%。

3 討論與結(jié)論

酚酸黃酮作為微量活性物質(zhì)，在不同植物中分布差異較大，可以利用其差異來(lái)進(jìn)行植物來(lái)源的判別。脫落酸作為一種植物激素，在植物干旱、高鹽、低溫和病蟲(chóng)害等逆境脅迫反應(yīng)中起重要的信號(hào)傳導(dǎo)作用，其含量變化與植物的種類及生長(zhǎng)環(huán)境密切相關(guān)[12]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)蜂蜜中多酚的研究較多，并已用于單花蜜的蜜源判別及摻假檢測(cè)。李菁等[8]對(duì)刺槐蜜的3種酚酸進(jìn)行研究，王文靜[13]對(duì)洋槐蜜中的3種黃酮進(jìn)行檢測(cè)，制定了洋槐蜜黃酮化合物指紋譜圖。周夢(mèng)遙[14]對(duì)油菜蜜、向日葵蜜中的10種多酚進(jìn)行檢測(cè)并制定相關(guān)圖譜。Lihu等[15]對(duì)澳大利亞5個(gè)植物屬的16種蜂蜜進(jìn)行了黃酮類物質(zhì)的分析，得出利用總黃酮含量來(lái)區(qū)分蜜種的結(jié)論。Mustafa等[16]對(duì)馬來(lái)西亞蜂蜜中的多酚物質(zhì)進(jìn)行分析，并對(duì)其抗炎性進(jìn)行研究，證實(shí)不同蜂蜜中多酚物質(zhì)含量不同，抗炎作用也不同。Isabel等[17]對(duì)西班牙地中海沿岸60種柑橘蜜及檸檬蜜的10種多酚物質(zhì)及37種揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，成功區(qū)分出兩種蜂蜜。本實(shí)驗(yàn)對(duì)8種蜂蜜的14種多酚進(jìn)行分離檢測(cè)，為單花蜜的蜜種識(shí)別及活性成分分析提供依據(jù)。

把脫落酸的檢測(cè)與蜂蜜蜜源識(shí)別相結(jié)合的研究在國(guó)內(nèi)較少，國(guó)外則相對(duì)成熟。Federico等[3]確定脫落酸為石楠花蜜的主要成分，并將其用于單花蜜的蜜源判斷。Lihu等[4]將脫落酸作為桉樹(shù)蜜地理來(lái)源的判別物。Izabela等[18]測(cè)定了土耳其石楠花蜜及蕎麥蜜中的脫落酸及酚酸，將總酚酸的含量與與脫落酸含量作為兩種蜂蜜植物來(lái)源的判別標(biāo)準(zhǔn)。Jasna等[19]利用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)斯洛維尼亞7種蜂蜜中的脫落酸及黃酮進(jìn)行了研究，用其含量及組成來(lái)區(qū)分7種蜂蜜。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)脫落酸及多酚含量高低，將脫落酸、楊梅酮及總酚含量作為荔枝蜜的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，將咖啡酸、α-兒茶酸含量作為枇杷蜜的判別標(biāo)準(zhǔn)；3,4-二甲氧基肉桂酸、木犀草素及脫落酸含量作為龍眼蜜的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，將蘆丁及山奈酚含量作為益母草蜜的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，α-兒茶酸、芹菜素作為棗花蜜的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，原兒茶酸作為紫云英蜜的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。這些研究結(jié)果進(jìn)一步表明將脫落酸的測(cè)定與多酚測(cè)定相結(jié)合將成為識(shí)別蜂蜜種類、鑒別單花蜜摻假的有效方法。

本實(shí)驗(yàn)雖然成功分離鑒別出了14種多酚，但研究過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)種類有限，尚有多酚物質(zhì)未能確定，這需要結(jié)合質(zhì)譜分析進(jìn)行進(jìn)一步的判斷。同時(shí)，采集樣品的數(shù)量有限，有關(guān)產(chǎn)地來(lái)源的分析及指紋圖譜的建立，還需要搜集不同地區(qū)的同種蜂蜜作進(jìn)一步的研究。

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