趙新 王永 蘭青闊 陳銳 李歐靜 余景會 朱珠 郭永澤

（天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，天津 300381）

大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）為十字花科蕓薹屬葉用蔬菜，原產(chǎn)于我國，營養(yǎng)豐富，易于儲存，因此廣受歡迎。大白菜品種繁多，不同品種的栽培技術(shù)、食用價值和經(jīng)濟(jì)價值也存在差異，因此對市售種子品種的鑒別非常關(guān)鍵，尤其是在農(nóng)戶播種之前利用最短的時間鑒別出種子品種的真實性，有效地降低勞動成本和經(jīng)濟(jì)損失尤為重要。傳統(tǒng)的田間形態(tài)學(xué)觀察是種子品種鑒定較為常用的方法，但時間較長且易受環(huán)境條件的影響，結(jié)果可能存在偏差，因此需要一種更加高效、準(zhǔn)確并且操作簡便的分子水平品種鑒定方法［1］。同時新品種的登記、測試，以及品種間的遺傳距離聚類分析也需要相關(guān)的分子輔助手段［2］。

近年來出現(xiàn)了多種分子生物學(xué)標(biāo)記技術(shù)，簡單重復(fù)序列SSR 標(biāo)記（也稱微衛(wèi)星技術(shù)）是其中的一種，與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比具有多態(tài)信息含量高、共顯性遺傳、技術(shù)簡單、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)等特點［3，4］，并且在雜交種品種鑒定中得到了大量應(yīng)用。隨著功能基因組學(xué)的迅速發(fā)展，GenBank中積累了許多重要物種的大量EST序列，這些序列獲取簡便，沒有任何費用，已經(jīng)成為發(fā)展SSR標(biāo)記的重要來源，因此基于表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，EST）的微衛(wèi)星（simple sequence repeats，SSR）標(biāo)記技術(shù)不僅保留了SSR標(biāo)記技術(shù)的所有優(yōu)點，而且凸顯了其便捷、花費低、效率高的優(yōu)勢；但SSR技術(shù)也存在著相對的不足，即一次試驗得到的位點較少，針對這一問題Tommasini等［5］發(fā)展了多重SSR分析技術(shù)，并有效地鑒定了油菜品種。

本研究以12份大白菜雜交種為試驗材料，利用新型分子標(biāo)記復(fù)合EST-SSR進(jìn)行大白菜品種鑒定研究，篩選其多態(tài)性特異譜帶，并以該譜帶作為分子標(biāo)記對其品種進(jìn)行區(qū)分。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為12份市售大白菜雜交種，由天津科潤蔬菜研究所提供，具體信息見表1。

表1 品種名稱及編號

1.2 方法

1.2.1 EST-SSR引物的開發(fā) 利用GenBank上公布的大白菜EST序列，設(shè)計合成30對核心引物，命名為BC1-BC30，引物由上海生工合成。

1.2.2 大白菜基因組DNA提取 利用改良CTAB法［6］分別提取12份大白菜雜交種葉片基因組DNA，將獲得的植物組DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 引物篩選 以大白菜雜交種的基因組DNA為模板，分別對30對EST-SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離、染色，在能夠得到有效擴(kuò)增的引物中篩選多態(tài)性高的特異譜帶，同時結(jié)合單一引物品種鑒定結(jié)果及特異譜帶的相互位置差異，優(yōu)化組合多個引物對，篩選復(fù)合EST-SSR標(biāo)記。

1.2.4 PCR擴(kuò)增體系及程序 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為10 μL，擴(kuò)增反 應(yīng)體系為：2×GoTaq?Master Mixes 5 μL，上下游引物10 μmol/L各0.25 μL（Ⅰ套EST-SSR復(fù)合引物中BC1上游引物、BC1下游引物、BC19上游引物、BC19下游引物、BC26上游引物、BC26下游引物均等量混合各0.25 μL；或Ⅱ套ESTSSR復(fù)合引物中BC1上游引物、BC1下游引物、BC9上游引物、BC9下游引物、BC10上游引物、BC10下游引物、BC16上游引物、BC16下游引物、BC27上游引物、BC27下游引物均等量混合各0.25 μL），供試品種大白菜基因組DNA模板，濃度50 ng/μL，1 μL，雙蒸水補(bǔ)足10 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 1 min，53.5℃ 45 s，72℃ 45 s 35個擴(kuò)增循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析及聚類圖譜構(gòu)建 根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜，每個樣品的特異性譜帶按照相互位置差異在相同遷移率位置上進(jìn)行有無的“1，0”標(biāo)注，根據(jù)標(biāo)注結(jié)果計算2套引物的多態(tài)率和多態(tài)信息量（PIC），分析2套引物對12份大白菜品種的鑒定結(jié)果，并應(yīng)用NTSYS聚類分析軟件構(gòu)建12份大白菜品種的聚類圖譜。

2 結(jié)果

2.1 大白菜葉片基因組DNA的提取

利用改良CTAB方法提取大白菜葉片基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果（圖1）顯示，所提取的基因組DNA主帶清晰，整齊一致，無明顯降解，可用于下一步PCR擴(kuò)增。

圖1 大白菜基因組DNA電泳圖

2.2 引物篩選結(jié)果

利用SSR技術(shù)對天津科潤蔬菜研究所提供的大白菜雜交種進(jìn)行了特異性分子標(biāo)記分析，共利用30對EST-SSR引物進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，其中21對得到有效擴(kuò)增，10對具有較高的多態(tài)率及多態(tài)信息量，根據(jù)這10對引物擴(kuò)增條帶的相互位置差異，進(jìn)行優(yōu)化組合，確定了2套復(fù)合引物可對12份大白菜品種進(jìn)行完全的區(qū)分。引物序列見表2，應(yīng)用2套復(fù)合引物對12份大白菜進(jìn)行品種鑒定的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜如圖2、圖3所示。

表2 引物序列

2.3 復(fù)合標(biāo)記12份大白菜品種的多態(tài)性分析及聚類分析結(jié)果

通過分析EST-SSR結(jié)果，比較12份大白菜品種間多態(tài)性位點的差異，確定2套復(fù)合引物的多態(tài)率及多態(tài)信息量；在相同遷移率位置上進(jìn)行“1，0”標(biāo)注，構(gòu)建12份大白菜品種的SSR分析譜帶數(shù)據(jù)（表3），通過數(shù)據(jù)分析復(fù)合引物是否可對12份大白菜品種進(jìn)行完全的區(qū)分，同時構(gòu)建12份大白菜品種的聚類圖譜（圖4）。

表3 復(fù)合EST-SSR引物組合鑒定大白菜品種的多態(tài)性分析

3 討論

隨著植物育種和種子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，植物新品種保護(hù)（Protection of New Varieties of Plant，簡稱PVP）作為知識產(chǎn)權(quán)的10種內(nèi)容之一，其重要性越來越突出。培育和推廣新的優(yōu)良品種是我國蔬菜育種發(fā)展的重要方向，因此新品種的準(zhǔn)確鑒定不僅是新品種審定和保護(hù)的前提，也為辨別假冒偽劣種子，保護(hù)自身知識產(chǎn)權(quán)，維護(hù)育種農(nóng)家的切身利益提供保障和科學(xué)依據(jù)。因此，開發(fā)高效、準(zhǔn)確的種子品種鑒定方法已成為種子科研單位和企業(yè)共同關(guān)注的課題。

近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，遺傳標(biāo)記經(jīng)過形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、蛋白質(zhì)標(biāo)記已經(jīng)發(fā)展到了DNA水平的標(biāo)記。各種DNA標(biāo)記技術(shù)在雜交種品種鑒定中層出不窮，EST-SSR是近幾年建立的新型分子標(biāo)記技術(shù)，目前已應(yīng)用于水稻、小麥、高羊茅、黑楊等［7-10］植物的分子連鎖圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析，證明了EST-SSR標(biāo)記進(jìn)行品種鑒定的可行性，該技術(shù)具有穩(wěn)定性高、共顯性、重復(fù)性好等特點，而且開發(fā)成本相對低廉。

為了進(jìn)一步提高EST-SSR的多態(tài)性，更加高效地進(jìn)行相關(guān)物種的品種鑒定，本研究以大白菜為試驗材料，摸索了多重EST-SSR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，構(gòu)建了2套復(fù)合EST-SSR引物組合可完全對12份大白菜品種進(jìn)行區(qū)分。復(fù)合引物標(biāo)記的構(gòu)建需要根據(jù)單一引物的相互位置差異進(jìn)行優(yōu)化組合，使單一引物的擴(kuò)增片段處在不同片段大小的區(qū)域，避免復(fù)合標(biāo)記的重疊性。復(fù)合EST-SSR標(biāo)記對大白菜雜交品種具有很好的區(qū)分效果，可通過一次反應(yīng)檢測到高水平的多態(tài)性，同時所建立的試驗組合、方法和思路，具有一定的推廣性，不僅僅局限于12份大白菜品種的鑒定，通過對30對核心引物的組合優(yōu)化，可以對更多的大白菜品種進(jìn)行標(biāo)記和鑒定的研究，進(jìn)而為有效地解決大白菜雜交種的鑒別問題提供技術(shù)參考。本研究的檢測方法在不計算DNA提取過程耗時的情況下，PCR耗時2 h，EST-SSR分析60-90 min，所以本發(fā)明的檢測方法在4 h之內(nèi)即可完成對大白菜品種的鑒定工作，具有高效、低成本、操作方便等優(yōu)勢。

4 結(jié)論

本研究僅以12份市售大白菜品種為例，通過EST-SSR標(biāo)記的特異譜帶進(jìn)行聚類分析，表明12份大白菜品種兩兩間的相似系數(shù)在0.53-0.96之間，平均值為0.75，以遺傳相似系數(shù)0.96為標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)合EST-SSR引物組合擴(kuò)增的特異性譜帶數(shù)據(jù)，能將市售大白菜的12份品種完全區(qū)分開。這些研究方法和結(jié)果對建立大白菜新種質(zhì)、新品種保護(hù)以及種苗質(zhì)量仲裁檢驗等都具有重要意義。

［1］ 趙新, 王永, 蘭青闊, 等. EST-SSR標(biāo)記在大白菜雜交種種子純度鑒定中的應(yīng)用［J］.分子植物育種, 2012, 10：1145-1150.

［2］ 李麗, 鄭曉鷹.用于白菜和大白菜品種鑒定的EST-SSR復(fù)合標(biāo)記的建立［J］.園藝學(xué)報, 2009, 36（11）：1627-1634.

［3］ 忻雅, 崔海瑞, 盧美貞, 等.白菜EST-SSR信息分析與標(biāo)記的建立［J］.園藝學(xué)報, 2006, 33（3）：549-554.

［4］ Powell W, Machray GC, Provan J, et al. Polymorphism revealed by simple sequence repeats［J］. Trends Plant Science, 1996, 1（7）：215-222.

［5］ Tommasini L, Batley J, Arnold GM, et al. The development of multiplex simple sequence repeat（SSR）markers to complement distinctness, uniformity and stability testing of rape（Brassica napus L.）varieties［J］. Theor Appl Genet, 2002, 106：1091-1101.

［6］ 王永, 蘭青闊, 張莉, 等.改良Chelex-100法和CTAB法用于轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆檢測效果的比較［J］.大豆科學(xué), 2008, 27（5）：898-901.

［7］ Cho YG, Ishii T, Tenmykh S, et al. Diversity of microsatellites derived from genomic libraries and GenBank sequences in rice（Oryza sativa L.）［J］. Theoretical and Applied Genetics, 2000, 100：713-722.

［8］ Eujayl I, Sorrells ME, Baum M, et al. Assessment of genotypic variation among cultivated durum wheat based on EST-SSRs and genomic SSRs［J］. Euphytica, 2001, 119：39-43.

［9］ 段乃彬, 王建成, 于天祥, 等.高羊茅EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)及品種鑒定［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 10：7-10.

［10］ 張亞東, 胡興宜, 宋叢文, 等.利用新型分子標(biāo)記EST-SSR鑒定湖北省內(nèi)的主栽黑楊品種［J］.分子植物育種, 2009, 7（1）：105-109.