于學珍

(煙臺正海生物技術有限公司 山東煙臺 264006)

培養(yǎng)基應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。應對高壓滅菌器的蒸汽循環(huán)系統(tǒng)進行驗證,確保在一定裝載方式下的正常熱分布。本實驗就是驗證滅菌器的滅菌程序,通過檢查培養(yǎng)基的靈敏度及無菌性來驗證滅菌程序。

1 材料與儀器

1.1 儀器設備(表1)

1.2 用具

培養(yǎng)皿,三角瓶,移液管,接種針,試管。

1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(110112)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(1112222)、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(111114)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(111015)、改良馬丁培養(yǎng)基 (1111242)、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(110910)(北京三藥科技開發(fā)公司)。

1.4 試劑

0.9%無菌氯化鈉溶液。

1.5 菌種

培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌種傳代次數(shù)不得超過5代。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003];大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102];枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501];白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001];黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]嗜熱脂肪桿菌(ATCC7953)(含菌量:5×105-5×106cfu/片)。

1.6 菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,30～35℃培養(yǎng)18-24h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中,23～28℃培養(yǎng)24～48h。將培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數(shù)50～100cfu(菌落形成單位)的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中,23～28℃培養(yǎng)5～7d,加入0.9%無菌氯化鈉溶液3～5mL,洗脫孢子。然后,用管口裝有薄的無菌棉花或紗布,能過濾菌絲的無菌毛細吸管吸出孢子懸液至無菌試管內,用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子50～100cfu的孢子懸液[2]。具體稀釋、計數(shù)操作如下。

取1mL培養(yǎng)物或孢子懸液加入0.9%無菌氯化鈉溶液9mL中,搖勻,即得10-1菌懸液,取其lmL加入0.9%無菌氯化鈉溶液9mL中,搖勻,即得l0-2菌懸液。依此類推,制得10-3,10-4,10-5,10-6,10-7菌懸液。分別吸取10-4,10-5或10-6,10-7菌懸液各1mL加入平皿中,倒入營養(yǎng)瓊脂或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基,凝固后倒置培養(yǎng)。每個稀釋級分別制備2個平行平板。白色念珠菌、黑曲霉培養(yǎng)72h計數(shù);大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌培養(yǎng)48h計數(shù)。每種菌均用每1mL含菌50～100cfu的稀釋級做培養(yǎng)基靈敏度檢查實驗.

1.7 F0值計算

D121:121.1℃下生物指示劑的D值(本實驗D121取值1.5)

A:微生物最初數(shù)量;B:微生物最終數(shù)量。若所有生物指示劑經滅菌實驗后培養(yǎng)均呈陰性則:F0=1.5×lg(6×5×105)=10則證明現(xiàn)有滅菌工藝能夠滿足生產需要。若滅菌實驗生物指示劑經培養(yǎng)后有呈現(xiàn)陽性者則實驗結果不被接受,認為現(xiàn)有滅菌工藝不能滿足生產需求,需更改滅菌條件。121℃飽和蒸汽條件下存活時間≥3.9min,殺滅時間≤19min,D=1.5-3.0。

2 確認步驟

2.1 滅菌器的溫度分布的均勻性

采用多路溫度分布儀,模擬滅菌的程序,測量滅菌器的溫度,采用平衡放置方式結果滅菌器的溫度是均勻的,再進行以下步驟的驗證。

2.2 嗜熱脂肪桿菌(ATCC7953)芽孢

將嗜熱脂肪桿菌(ATCC7953)芽孢放入滅菌器中,采用滿載的情況下滅菌15分鐘和20分鐘后,培養(yǎng),顯示在滅菌15分鐘和20分鐘均能夠殺死嗜熱脂肪桿菌(ATCC7953)芽孢,表明滅菌徹底。

2.3 培養(yǎng)基靈敏度檢查

2.3.1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、硫乙醇流體培養(yǎng)基

表1

表2

分別取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌菌懸液各1mL,①加入到滅菌15分鐘及20分鐘的硫乙醇流體培養(yǎng)基中,②分別注入無菌平皿中,立即傾注滅菌15分鐘及20分鐘的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,每株實驗菌平行制備每種培養(yǎng)基2個平皿,混勻,凝固,30～35℃培養(yǎng)48h,計數(shù)。

表3

2.3.2 玫瑰紅納培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基

分別取白色念珠菌、黑曲霉各1mL,①加入到滅菌15分鐘及20分鐘的改良馬丁培養(yǎng)基中,②分別注入無菌平皿中,立即傾注滅菌15分鐘及20分鐘的玫瑰紅納培養(yǎng)基,每株實驗菌平行制備每種培養(yǎng)基2個平皿,混勻,凝固,20-25℃培養(yǎng)72h,計數(shù)。

3 試驗結果

3.1 液體培養(yǎng)基(表2)

3.2 固體培養(yǎng)基(表3)

4 結果判斷標準

通過以上三步能夠達到確定培養(yǎng)基的滅菌參數(shù)。

相關定義:

D值:為使某一微生物的數(shù)量在規(guī)定的條件下減少一個數(shù)量級或90%所需的作用時間。

F值:熱力滅菌法對微生物滅活能力的度量值。

Z值:使D值變化一個數(shù)量級所需調整溫度的度數(shù)。

F0值:Z值為10K,D值為1min時,在121.1℃(250)下計算出的F值.

[1]汪穗福.微生物檢測驗證技術[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2005:68—69.

[2]國家藥典委員會.《中國藥典》2010年版二部[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005:附錄ⅪJ.

[3]《GB 18278-2000醫(yī)療保健產品滅菌確認和常規(guī)控制要求 工業(yè)濕熱滅菌》.

[4]《QM/ZHB.S.00.10.19.A LDZX型立式壓力蒸汽滅菌器標準操作規(guī)程》.