馬克世 王永立 高磊

(周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院 河南周口 466001)

低等動(dòng)物不像高等脊椎動(dòng)物可以提取骨髓制備染色體分散片,其染色體的制備方法較少,很多動(dòng)物因?yàn)槎紱]能制備出合適的染色體片,而導(dǎo)致其相關(guān)遺傳學(xué)研究收到影響。國(guó)內(nèi)關(guān)于低等扁蟲類染色體制備的方法最早見于李光鵬[1],一些研究者也曾進(jìn)行過方法的改進(jìn)[2,3],染色體制備方法的改進(jìn)目的在于得到理想的結(jié)果,為進(jìn)一步揭示它的生命現(xiàn)象本質(zhì)提供可靠的遺傳資料,本研究在前人基礎(chǔ)上,采用離心重懸,對(duì)低等扁蟲染色體制備各環(huán)節(jié)進(jìn)行了相應(yīng)改進(jìn),以供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

采自南陽寶天曼的活體扁蟲數(shù)條

1.2 藥品

0.02%秋水仙素,0.1%KCL溶液,固定液I(酒精:冰醋酸:蒸餾水=3:3:4),固定液II(酒精:冰醋酸=1:1),固定液III(酒精:冰醋酸=1:4),5%Giemsa染色液。

圖1 扁蟲再生切割示意圖

圖2 淡水扁蟲染色體分散片

1.3 方法

(1)再生組織的培養(yǎng)。取饑餓一周左右的健康蟲體,用單面刀片于咽前和咽后切斷蟲體(如圖1),片段放入培養(yǎng)皿加去氯自來水,控溫15℃左右(冬季室內(nèi)即可),培養(yǎng)3～5天。

(2)分離再生組織。再生良好的片段,用毛筆輕輕移至培養(yǎng)皿蓋上,用單面刀片切下1mm左右的再生片段,放入去氯水的潔凈培養(yǎng)皿中,余下蟲體片段繼續(xù)培養(yǎng),可用于有關(guān)再生的其他實(shí)驗(yàn)。

(3)秋水仙素處理。分離得到的再生組織,加入少許0.02%秋水仙素(以能淹沒材料為宜),然后在培養(yǎng)箱(15℃左右)中,處理1.5～2.5小時(shí),觀察材料狀況,以近似圓形或橢圓形無解體現(xiàn)象者為優(yōu)。

(4)低滲處理。將處理良好的再生組織,用0.1%KCL溶液沖洗2-3次,再加入少許0.1%KCL溶液,后于培養(yǎng)箱內(nèi)處理1～1.5小時(shí)左右。

(5)離心重懸。將上述低滲處理過的組織移入2ml離心管,用無菌大頭針輕輕搗碎。然后加入ml固定液I震蕩30s,后1000r離心,棄上清；再加入固定液II重復(fù)一次。

(6)固定分離后細(xì)胞。上述離心管中,加入1ml固定液III,震蕩30s,將混合液懸滴于干凈的載玻片上,室溫晾干即可。

(7)染色。上述制片用5%的Giemsa染液染色10-15分鐘左右,用蒸餾水輕輕洗去多余的染液,室溫晾干。

(8)封片。先在顯微鏡下粗略觀察,選擇染色體分散良好的涂片,用中性樹膠(二甲苯稀釋適中),封片保存。

2 結(jié)果

淡水扁蟲染色體分散片如圖2。

3 討論

離心重懸處理是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),它既可以去除細(xì)胞碎片的染色干擾,又可以使中期分裂細(xì)胞適度的破裂,得到分散良好的染色體結(jié)果。整個(gè)操作過程最好在室溫(20℃)左右進(jìn)行,而材料處理過程在15℃左右的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行,結(jié)果顯示:中期分裂相多,染色體形態(tài)完整清晰。溫度過高易導(dǎo)致操作過程和/或處理過程中扁蟲再生片段的解體,很難完成實(shí)驗(yàn)。當(dāng)然,以上幾個(gè)環(huán)節(jié)的操作可適當(dāng)調(diào)整,進(jìn)一步優(yōu)化。

[1]李光鵬.淡水渦蟲染色體的制備方法[J].動(dòng)物學(xué)雜志,1992,27(5):30-31.

[2]馬金友,陳廣文,劉德增.中國(guó)淡水三角渦蟲的染色體研究(I)[J].遺傳學(xué)報(bào),2003,30(11),1045-1050.

[3]劉翔.淡水渦蟲染色體的制備方法[J].氨基酸和生物資源,2004,26(4):30～31.