潘開瑞 劉衛(wèi)紅

(1.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑室 河南鄭州 450000;2.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 河南鄭州 450000)

隨著人民生活水平的提高和生活方式的改變,肥胖已成為多發(fā)病和影響人類健康的危險(xiǎn)因素之一,成為迫切需要解決的問題。脂肪組織包含脂肪細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,脂肪組織分泌的50余種生物活性分子統(tǒng)稱為脂肪因子。這些脂肪因子通過自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌作用方式,形成代謝-神經(jīng)內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)期處于能量過度攝入狀態(tài)時(shí),脂肪組織在其體積增大的同時(shí),分泌各種脂肪因子參與代謝綜合征各組分如胰島素抵抗、2型糖尿病、血脂紊亂、高凝狀態(tài)等的發(fā)生,并可直接作用于血管,促發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[1,2]。

充分理解脂肪因子功能,治療才能更加有效和明確,中醫(yī)藥以整體觀辨證論治,防治結(jié)合,更符合減肥基本原則,臨床應(yīng)用澤瀉治療肥胖癥,取得了較好的臨床療效,本實(shí)驗(yàn)通過觀察其對(duì)體外培養(yǎng)的前體脂肪細(xì)胞增殖以及凋亡的影響,以期揭示其治療單純性肥胖療效產(chǎn)生的分子機(jī)制,為減肥中藥推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

(1)細(xì)胞株:3T3-L1細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。(2)試劑:RPMI1640培養(yǎng)基,胰蛋白酶、胎牛血清,SDS(十二烷基硫酸鈉)、EDTA(乙二胺四乙酸),96孔細(xì)胞培養(yǎng)板;吖啶橙。(3)儀器:Milli-Q型超純水儀(美國(guó)Milipore公司),CK40倒置顯微鏡(日本Olympus公司),CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司),熒光顯微鏡BX41。(4)試藥:澤瀉購(gòu)自河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥房,水煮提取,高壓滅菌,4℃?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

細(xì)胞在含有100IU·L-1青霉素和100μg·mL-1鏈霉素、10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基,37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為正常對(duì)照組,不同濃度澤瀉(0.001-10mg/ml)組。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞調(diào)制成密度約1×105·mL-1的細(xì)胞懸液,加入96孔板,每孔100μL,37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24h,待細(xì)胞貼壁后,更換無血清培養(yǎng)基,加入不同濃度的澤瀉(0.001-10mg/ml),倒置顯微鏡下觀察,同時(shí)記錄細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)變化。

2.3 AO/EB染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取10mg/ml組作為刺激組。在6孔培養(yǎng)板中預(yù)先置入玻璃蓋玻片,接種細(xì)胞懸液,10mg/ml澤瀉干預(yù)后,予95%乙醇固定15分鐘,微干,然后準(zhǔn)備熒光染色。將100mg/L溶于PBS的吖啶橙和100mg/L溶于PBS的溴化乙錠各5μl在照相前混勻后加入,輕輕吹打,30秒后用熒光顯微鏡觀察照相。觀察正常對(duì)照組和10mg/ml澤瀉組凋亡情況。

3 結(jié)果

3.1 澤瀉對(duì)前體脂肪細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果如圖1所示,不同濃度的澤瀉作用于前體脂肪細(xì)胞24小時(shí)候,細(xì)胞增殖發(fā)生變化,各組間細(xì)胞活性比正常組降低,且10mg/ml組與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(圖1)

3.2 凋亡形態(tài)學(xué)改變

結(jié)果圖2所示,光鏡下可見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),長(zhǎng)梭形,經(jīng)過AO/EB染色后,胞核為均一,均質(zhì)的綠色熒光,經(jīng)過中藥刺激組可見細(xì)胞核邊聚,固縮,可見溴乙啶染色的橙黃色熒光。（圖2）

4 討論

圖1 不同濃度澤瀉作用于前體脂肪細(xì)胞的細(xì)胞的MTT增殖活性(0.001-10mg/ml)

流行病學(xué)研究表明,我國(guó)青少年單純性肥胖癥已處于失控的奇高狀態(tài)。脂肪組織被認(rèn)為不僅是能量?jī)?chǔ)存器官,而且是功能活躍的內(nèi)分泌器官。脂肪因子在代謝綜合征的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用,尤其是肥胖時(shí)內(nèi)臟脂肪組織分泌的促炎癥脂肪因子可直接導(dǎo)致胰島素抵抗和血管損傷,等[3,4]?；谥疽蜃訛樗幬锇悬c(diǎn)的減肥防治策略已成為比較關(guān)注的方向。臨床中許多中草藥在治療肥胖中具有較好的療效,因此,中藥成分對(duì)肥胖的作用已成為關(guān)注的熱點(diǎn)[5]。

圖2 前體脂肪細(xì)胞的凋亡形態(tài)學(xué)改變:A,B,C組為正常對(duì)照組的光鏡照片,D,E,F組為正常組染色結(jié)果;G,H,I組為刺激組的染色結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同濃度的澤瀉(0.001-10mg/ml)作用前體脂肪細(xì)胞24h使細(xì)胞增殖活性下降,能夠明顯抑制細(xì)胞的增殖,并且呈現(xiàn)劑量依賴性,10mg/ml組與正常對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示澤瀉有可能具有抑制細(xì)胞增殖作用。

細(xì)胞正常情況和早期凋亡情況下,細(xì)胞核染色亞啶橙染色,當(dāng)細(xì)胞處于晚期凋亡時(shí)候,溴乙啶染色細(xì)胞核。AO/EB凋亡染色結(jié)果顯示,正常組細(xì)胞細(xì)胞核亞啶橙染色,而10mg/ml的澤瀉作用后細(xì)胞核溴乙啶著色。這與MTT結(jié)果相吻合,提示澤瀉可能通過抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡來做用于前體脂肪細(xì)胞。這可能為中藥減肥藥物的作用機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。之后的實(shí)驗(yàn)還將從脂肪因子相關(guān)基因及其蛋白表達(dá)活性進(jìn)一步闡述澤瀉對(duì)前體脂肪細(xì)胞作用的機(jī)理。

[1]路玲玲,宰軍華,崔琳,李強(qiáng),張莎莎,金小琴.人脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建[J].世界科學(xué)技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2013,15(1):55-61.

[2]崔琳,李強(qiáng),路玲玲,宰軍華,張莎莎.脂聯(lián)素調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因熒光素酶活性的分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志.2013,19(6):211-215.

[3]岳杉,耿厚法,班博.BRL37344對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂肪分解與脂肪因子表達(dá)的影響[J].山東醫(yī)藥,2012,52(17):10-12.

[4]岳晶晶,周芹,何慶等.不同頻率間歇低氧對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子和脂肪因子的影響[J].天津醫(yī)藥,2012,40(4):308-311.

[5]孫陽,陳樹春.內(nèi)皮祖細(xì)胞與脂肪因子[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2012,32(6):1312-1314.