楊陽

(黑龍江護理高等?？茖W校 黑龍江哈爾濱 150000)

本文旨在探討分析抗雌激素藥物他莫昔芬的尿中代謝產(chǎn)物的檢測和鑒定,具體報告如下:

1 儀器與試藥

(1)儀器。氣質聯(lián)用儀生產(chǎn)廠家Agilent,型號5973/6890;色譜柱為HP-1氣相色譜柱(毛細),長度17m,內(nèi)徑200μm,厚度0.11μm,5%苯基交聯(lián)甲基聚氧硅烷;載氣為0.9ml/min流速的氦氣;柱頭壓力為113kPa;進樣口設定溫度為280℃;檢測接口設定溫度為290℃;升溫程序為初始溫度180℃,以3.3℃/min提升至231℃,后以30℃/min提升至310℃,2分鐘保留;進樣方式為分流進樣,以1:8.9為分流比,以10ml/min為分流口流速;進樣體積為2μl;質譜電離方式為EI,電子能力為70ev;采集模式為全范圍掃描m/z 50-650amu[1]。

(2)試藥。他莫昔芬:阿斯利康白色片劑,由英國捷利康公司生產(chǎn),每片含15.2mg枸櫞酸他莫昔芬(即10mg他莫昔芬)。

(3)陽性尿樣收集。選取20名健康的男性志愿者,在服用藥物之前收集2次尿液,于清晨空腹狀態(tài)下服用藥物,在服用藥物后的72小時內(nèi)收集各次排尿,和72小時后的4天內(nèi)的晨尿,對每次排尿的體積和時間進行記錄。志愿者服用他莫昔芬的劑量為1片阿斯利康白色片劑(即10mg他莫昔芬)。

(4)陽性尿樣前提取方法。提取所有志愿者服用藥物之前尿樣和服用藥物36小時后的尿樣各5ml,pH值在6.4-6.7范圍。以固相萃取-酶解-液相萃取-氣質聯(lián)用儀上樣分析的前提取方法處理。具體操作為:將尿樣(5ml)置于試管內(nèi),在離心后收集上清液放置在C18柱之上,用水(5ml)對柱床洗滌,再用甲醇(4ml)洗脫,收集洗脫液放置在旋轉蒸發(fā)儀上,以50℃講甲醇蒸出。在蒸干物至放入加pH值6.8的磷酸鹽緩沖液(1ml)及β-葡萄糖醛酸甙酶(50μl),在渦旋混勻后,放置在55℃的水浴箱中進行3小時酶解,在酶解完成后,將試管取出,放入固體緩沖鹽(0.1g),將pH值調至8.8,放入叔丁基甲醚(5ml)進行萃取,再放置在渦旋振蕩器上進行1分鐘混合,以2500rpm進行5分鐘離心,以吸管收集上層的醚液,放置到干燥的試管內(nèi),在氮氣(65℃)下將其吹干,使用氣質聯(lián)用儀上樣分析[2]。

(5)他莫昔芬的尿中代謝產(chǎn)物結構鑒定。對代謝產(chǎn)物標準品的合成,經(jīng)EI與CI對比進樣分析、高分辨質譜對分子量測定并擬合分子式、串聯(lián)質譜到離子譜來分析。以氣相色譜與高分辨質譜聯(lián)用,經(jīng)色譜柱分離樣品后,在不同的時間進入到高分辨質譜中,用精確質量(PFK峰)對測量到的質量數(shù)進行校準,使用計算軟件得出元素組成。

2 結果

表1 尿中原型和代謝產(chǎn)物的檢出情況

(1)尿中代謝產(chǎn)物檢測情況。結果顯示尿中代謝產(chǎn)物主要為結合型葡萄糖醛酸,少數(shù)為游離型葡萄糖醛酸(不穩(wěn)定)。尿樣經(jīng)過酶解后提取,在提取的離子色譜圖可見代謝物峰。同時和提取的服用藥物之前尿樣的離子色譜圖對比,發(fā)現(xiàn)17.54分鐘為代謝物峰,即雌激素藥物他莫昔芬尿中主要代謝產(chǎn)物Met.C,分子量是417。在17.30分鐘發(fā)現(xiàn)另外一個較低的代謝物峰,分子離子為473,此代謝產(chǎn)物為Met.U,即抗雌激素藥物他莫昔芬的尿中代謝產(chǎn)物主要為Met.C與Met.U。尿中原型和代謝產(chǎn)物的檢出情況,詳見表1:

(2)他莫昔芬的尿中代謝產(chǎn)物結構鑒定。結果發(fā)現(xiàn)他莫昔芬的尿中代謝產(chǎn)物的元素組成是C30H39O3NSi,在EI與CI的譜圖上可見m/e489(M+)與m/e490(M+1),證實MSTFA的產(chǎn)物分子量為489。

3 討論

抗雌激素藥物,即雌激素受體的抑制劑,是對雌激素受體作用的一類藥物,該藥物能夠和雌二醇爭奪雌激素受體,發(fā)揮阻斷雌激素的作用。臨床主要應用該藥物治療乳腺癌、不孕不育癥等和激素有關的疾病。但近年來,濫用興奮劑者將該藥物用于男性參加的體育競賽當中,使體內(nèi)的睪酮水平提高,同時對抗服用了外源性的類固醇所產(chǎn)生的副作用。IOC在2003年頒布的禁用物質和禁用方法表中明確規(guī)定男性禁用抗雌激素藥物(他莫昔芬,氯米芬,環(huán)芬尼)[3]。為了建立常規(guī)檢測抗雌激素藥物他莫昔芬陽性尿樣的方法,對抗雌激素藥物他莫昔芬的尿中代謝產(chǎn)物進行結構鑒定,我們選擇他莫昔芬作為研究藥物,對該藥在尿中的代謝產(chǎn)物進行檢測和鑒定分析。本研究通過GC/MS技術檢測和鑒定抗雌激素藥物他莫昔芬的尿中代謝產(chǎn)物。檢測結果證實,志愿者服用藥物后的排出的尿液中只有少量的他莫昔芬代謝產(chǎn)物提示該藥在體內(nèi)代謝廣泛,但不經(jīng)尿液排出,而是通過膽汁排出。他莫昔芬是三苯氧胺結構藥物,脂溶性相對較高,極易通過腎小管重復吸收,長期停留在體內(nèi)。另外,該藥在體內(nèi)的代謝還進行肝腸循環(huán),在以葡萄糖醛酸甙的形式進入膽汁,腸道吸收較慢,經(jīng)β-葡萄糖醛酸水解酶的水解成原型,使脂溶性增大,又經(jīng)腸道吸收進入到門靜脈,使尿液中的代謝產(chǎn)物存留時間延長,單劑量服用該藥物,在20天后仍可檢出。

綜上所述,采用GC/MS技術檢測和鑒定抗雌激素藥物他莫昔芬的尿中代謝產(chǎn)物準確可靠,抗雌激素藥物他莫昔芬的尿中代謝產(chǎn)物主要為Met.C,分子式C27H31NO3,分子量417。

[1]劉先軍,張晶,邵兵,等.固相萃取-液相色譜串聯(lián)質譜法測定城市污水中他莫昔芬和來曲唑[J].分析化學,2012,38(2):214-218.

[2]馬宗會,樊在霞,聶華麗,等.他莫昔芬微膠囊的制備及體外藥物釋放性能研究[J].中國藥學雜志,2008,43(16):1248-1251.

[3]張倩,朱余兵,于翠霞,等.枸櫞酸他莫昔芬分散片在健康人體的藥動學和生物等效性研究[J].中國臨床藥理學與治療學,2008,13(3):303-307.