田向楠 田斌* 張雪娟 周知里 馬煥成

(西南林業(yè)大學(xué)國(guó)家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南昆明 650224)

木棉(Bombax ceiba L.)別名紅棉、攀枝花、英雄樹(shù)等,為木棉科(Bombacaceae)木棉屬落葉高大喬木,主要生長(zhǎng)在熱帶及亞熱帶地區(qū),具有很高的觀賞、藥用、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)木棉的研究主要集中于木棉的傳粉生物學(xué)、組織培養(yǎng)、化學(xué)成分分析、纖維理化性質(zhì)等方面。有關(guān)遺傳多樣性及種質(zhì)資源鑒定等方面的研究報(bào)道相對(duì)較少。

圖1:4種方法提取的木棉基因組DNA電泳圖譜

圖2:改良后的4種方法提取木棉基因組DNA的電泳圖譜

近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,基因工程和分子標(biāo)記等分子生物技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物的種植資源鑒定及遺傳多樣性分析等方面。而高質(zhì)量的DNA是進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的保障。目前提取植物DNA的方法主要有CTAB法、SDS法、高鹽低PH法、以及基于試劑盒的膜吸附法和磁珠法等。研究者需根據(jù)研究材料的特點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)?zāi)康膬?yōu)化DNA提取方法。因此本文通過(guò)8種不同的DNA提取方法對(duì)其進(jìn)行總DNA提取,并對(duì)所提取的DNA純度和產(chǎn)率等方面進(jìn)行分析對(duì)比,以得出最優(yōu)的木棉基因組DNA的提取方法,為今后的分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料

供試材料為硅膠干燥后的成熟木棉葉片,于2012年9月份分別取自普洱市耿馬縣(北緯23°12′;東經(jīng)101°08′),怒江州瀘水縣(北緯25°85′;東經(jīng)98°85′)。

1.1.2 主要儀器、試劑

主要儀器:自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋,電子天平,磨樣機(jī),恒溫水浴鍋,低溫離心機(jī),凝膠成像系統(tǒng),電泳儀,NanoDrop 2000微量紫外-分光光度計(jì),冰箱。

主要試劑:(1)預(yù)處理液:1.4mol/L NaC1；20mmol/L EDTA；100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)；0.2%β-巰基乙醇,混合后最終調(diào)至pH為8.0,高壓滅菌。(2)CTAB提取緩沖液:2%CTAB；1.4mol/L NaCl；20mmol/L EDTA,100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)；0.2%β-巰基乙醇混合后最終調(diào)至pH為8.0,高壓滅菌。(3)SDS提取緩沖液:1mol/L Tris-HCl(pH8.0),20mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl,1.5% SDS,高壓滅菌。(4)TE:10mmol/L Tris-HCl(pH=8.0),0.1mmol/L EDTA。(5)CI:v(氯仿):v(異戊醇)=24:1。(6)v(酚):v(氯仿):v(異戊醇)=25:24:1。(7)75%乙醇及無(wú)水乙醇。

1.2 DNA提取方法

稱取0.02g硅膠干燥的木棉葉片于2mL離心管中,加入少量的PVP粉及兩顆鋼珠,在干樣磨樣機(jī)上充分研磨2min左右,使之完全成為細(xì)粉。隨后運(yùn)用不同的提取方法提取總DNA。

1.2.1 傳統(tǒng)的CTAB法

傳統(tǒng)的CTAB法參照Clark等的方法提取。

1.2.2 傳統(tǒng)的SDS法

參照王景雪等的方法提取。

1.2.3 普通基因組DNA抽提試劑盒(膜吸附法)

普通試劑盒為Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(產(chǎn)品編號(hào):SK8262),提取方法步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 磁珠基因組DNA抽提試劑盒

磁珠法基因組DNA抽提試劑盒(產(chǎn)品編號(hào):SK8732),提取方法步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 改良的普通基因組DNA抽提試劑盒(膜吸附法)

普通試劑盒為Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(產(chǎn)品編號(hào):SK8262),提取方法為:首先用預(yù)處理液將材料處理,之后參照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.6 改良的磁珠基因組DNA抽提試劑盒

改良的磁珠法基因組DNA抽提試劑盒(產(chǎn)品編號(hào):SK8732),提取方法為:首先用預(yù)處理液將材料處理,之后參照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.7 改良的CTAB法

(1)加入1000μL 65℃預(yù)熱的處理液,使之充分混勻,4℃12000r/min離心機(jī)離心10min使之分層,倒掉上清液。(2)加入800μ L 65℃預(yù)熱的CTAB,3μL β-巰基乙醇,在65℃水浴鍋中預(yù)熱40-60min,期間輕輕搖勻幾次。(3)加入等體積的酚:氯仿:異戊醇,緩慢反轉(zhuǎn)離心管10min,使內(nèi)含物充分混勻后并成乳濁液,在4℃12000r/min離心機(jī)上離心10min使之分層,取上清液,轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中。(4)加入等體積氯仿:異戊醇,緩慢反轉(zhuǎn)離心管10min,使內(nèi)含物充分混勻后并成乳濁液,在4℃ 12000r/min離心機(jī)上離心10min使之分層,取上清液,轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中。(5)重復(fù)第4步。(6)在抽提的上清液中加入其2/3體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇,輕輕搖勻離心管,放入-20℃冰箱內(nèi)沉淀40min。(7)4℃ 12000r/min離心機(jī)上離心8min,棄上清液,用600μL 75%乙醇清洗沉淀,4℃12000r/min離心8min,重復(fù)此步驟一次。(8)用600μL無(wú)水乙醇清洗沉淀,4℃12000r/min離心8min,倒掉液體。(9)然后將沉淀至于溫室下自然風(fēng)干。(10)自然風(fēng)干后,加入100μL TE緩沖液。

1.2.8 改良的SDS法

(1)加入1000μL 65℃預(yù)熱的處理液,使之充分混勻,4℃12000r/min離心機(jī)離心10min使之分層,倒掉上清液。(2)加入1000μL 65℃預(yù)熱的SDS提取液,加入100μL 5mol/L KAc (pH 4.8),加入10 μL β-巰基乙醇,少量PVP粉,充分混勻后于65℃水浴30min。4℃12000r/min離心10min,吸上清液。(3)加入等體積的酚:氯仿:異戊醇,緩慢反轉(zhuǎn)離心管10min,使內(nèi)含物充分混勻后并成乳濁液,在4℃12000r/min離心機(jī)上離心10min使之分層,取上清液,轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中。(4)加入等體積氯仿:異戊醇,緩慢反轉(zhuǎn)離心管10min,使內(nèi)含物充分混勻后并成乳濁液,在4℃ 12000r/min離心機(jī)上離心10min使之分層,取上清液,轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中。(5)重復(fù)第4步。(6)在抽提的上清液中加入其2/3體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇,輕輕搖勻離心管,放入-20℃冰箱內(nèi)沉淀40min。(7)4℃ 12000r/min離心機(jī)上離心8min,棄上清液,用600μL 75%乙醇清洗沉淀,4℃ 12000r/min離心8min,重復(fù)此步驟一次。(8)用600μL無(wú)水乙醇清洗沉淀,4℃12000r/min離心8min,倒掉液體。(9)然后將沉淀至于溫室下自然風(fēng)干。(10)自然風(fēng)干后,加入100μL TE緩沖液。

1.3 DNA的含量檢測(cè)

1.3.1 電泳檢測(cè)

取DNA樣品4μL與2μL 6×Loading buffer混勻后上樣,1×TAE電泳緩沖液,8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量,2000bp Marker 6μL,120V電泳20min,電泳結(jié)束后,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察照相。

1.3.2 DNA純度與質(zhì)量濃度檢測(cè)

用NanoDrop2000微量紫外-分光光度計(jì)測(cè)定樣品液的純度及質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外分光光度計(jì)測(cè)定

分別將8種不同方法提取的木棉D(zhuǎn)NA樣品在紫外分光光度計(jì)下測(cè)量其產(chǎn)率及A260/A280的比值,可以得出木棉基因組DNA質(zhì)量濃度:改良的CTAB法>改良的磁珠法試劑盒>磁珠法試劑盒>普通試劑盒法>改良的普通試劑盒法>改良的SDS法>CTAB法>SDS法；除改良的普通試劑盒DNA產(chǎn)率下降外,其余三種方法CTAB法,SDS法及磁珠法試劑盒經(jīng)過(guò)改良后DNA產(chǎn)率都有所提高且CTAB法十分顯著。就其A260/A280的比值可以得出DNA的純度:改良的磁珠法試劑盒>改良的普通試劑盒法>磁珠法試劑盒>改良的CTAB法>普通試劑盒法>改良的SDS法>CTAB法>SDS法。此外,經(jīng)過(guò)改良后DNA純度都有所提高,且CTAB法和SDS法比較明顯,經(jīng)改良后的磁珠法試劑盒A260/A280的平均比值為1.93在1.8-2.0之間純度較高,其余方法均在1.8以下,存留蛋白質(zhì)多糖等次生代謝物質(zhì)。綜合DNA得率及純度比較分析可以得出:改良的磁珠法試劑盒提取的木棉基因組DNA效果最佳。

2.2 八種方法提取木棉基因組DNA的電泳檢測(cè)結(jié)果

從8種方法提取DNA的瓊脂糖電泳圖譜(圖1)可以看出,常規(guī)CTAB法和常規(guī)SDS法均有嚴(yán)重的拖帶現(xiàn)象,且點(diǎn)樣孔有殘留物,DNA條帶不清晰甚至沒(méi)有。普通試劑盒與磁珠法試劑盒DNA主帶比較清晰,無(wú)拖帶現(xiàn)象,但點(diǎn)樣空有輕微的殘留物。從電泳圖譜(圖2)可以看出除改良的SDS法DNA主帶不清晰,其余三種改良的CTAB法、改良的普通試劑盒法及改良的磁珠試劑盒法DNA主帶清晰,無(wú)拖帶現(xiàn)象。改良的CTAB法與改良的普通試劑盒法點(diǎn)樣空仍有少量雜質(zhì),而改良的磁珠法試劑盒點(diǎn)樣空干凈無(wú)雜質(zhì)。

3 結(jié)語(yǔ)

由于木棉葉片中含有大量的多糖、多酚、萜類等物質(zhì),能成功地從木棉材料中提取高質(zhì)量DNA的關(guān)鍵是如何有效的去除多糖、蛋白質(zhì)及一些次生物質(zhì)。采用常規(guī)的CTAB法、SDS法、及試劑盒均得不到較高質(zhì)量的基因組DNA。CTAB法、SDS法、普通試劑盒及磁珠法試劑盒經(jīng)過(guò)改良處理后DNA的綜合質(zhì)量均得到了提高。并且能用于下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。這是由于在植物細(xì)胞中,生物膜將細(xì)胞不同部位隔離開(kāi)形成不同區(qū)室,多酚、多糖及萜類等次生物質(zhì)主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,所以在裂解細(xì)胞核前,先對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理,先將細(xì)胞破碎以除去細(xì)胞質(zhì)中的多糖多酚及萜類等次生物質(zhì)。并在細(xì)胞核裂解前加入少量的PVP粉,可與酚類物質(zhì)結(jié)合形成水不溶性的復(fù)合物,同時(shí)也能與多糖結(jié)合,進(jìn)一步去除預(yù)處理后余留的多酚多糖等雜質(zhì)。

本研究表明,改良后的CTAB法、普通試劑盒及磁珠法試劑盒均得到了較高質(zhì)量的DNA。但各有其優(yōu)缺點(diǎn),改良后的CTAB法為一種較為經(jīng)濟(jì)的植物總DNA提取方法,但其耗時(shí)較長(zhǎng),所用藥品中的苯酚、氯仿等對(duì)人體毒性很大,并且純度不夠高有少量的雜質(zhì)。改良后的普通試劑盒其操作簡(jiǎn)單,耗時(shí)少,其純度要比改良的CTAB法高,但其產(chǎn)率卻偏低。改良的磁珠法試劑盒無(wú)論提取純度、得率都為最好,其具有獨(dú)特分離作用的磁珠和緩沖液系統(tǒng),從樣品中分離純化高質(zhì)量核酸,特殊包被的磁珠,在一定條件下對(duì)目的核酸具有很強(qiáng)的親和力,而當(dāng)條件改變時(shí),磁珠釋放吸附的核酸,能夠達(dá)到快速分離純化核酸的目的。整個(gè)過(guò)程不涉及有毒試劑,安全、便利、提取的核酸純度高、質(zhì)量可靠。但缺點(diǎn)是其費(fèi)用較高。各實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)要求及條件選擇最適合的DNA提取方法。

[1]鄭翊旻,陳穎.木棉科的四種觀賞樹(shù)木[J].廣東園林,2006,28(5):42.

[2]鄭艷玲,馬煥成,Scheller Robert,等.環(huán)境因子對(duì)木棉種子萌發(fā)的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2013,33(2):1-7.

[3] Xiao H, Yu W D, Shi M W.Structures and performances of the kapok fiber[J]. Journal of Textile Research,2005,26(4):4-6.

[4]王景雪,孫毅,高武軍.一種簡(jiǎn)便實(shí)用的植物總DNA提取方法[J].山西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2000,23(3):271-272.

[5]王富榮,佟兆國(guó),等.野生桃幼葉DNA提取方法的改良研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,(5):66-69.