王大紅 劉飛

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽 471023；2.南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南陽 473061）

Epothilone B是由德國生物技術(shù)研究中心首次從纖維堆囊菌分離得到的十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合物［1］，該物質(zhì)能促進(jìn)微管蛋白聚合，水溶性好，其活性是紫杉醇的2 000-3 000倍［2-4］。目前，美國、瑞士等國開始從事相關(guān)研究，而我國主要是山東大學(xué)、華南理工等機(jī)構(gòu)做了一些相關(guān)研究。2007年由美國施貴寶公司開發(fā)的Epothilone B內(nèi)酰胺衍生物Ixabepilone獲得FDA批準(zhǔn)在美國上市，這是第一個(gè)上市的Epothilones衍生物，每毫克大約70美元［5］。目前纖維堆囊菌So.ce 90菌的產(chǎn)量低，雖然在發(fā)酵過程中通過補(bǔ)料方式或不斷更新吸附樹脂可以提高Epothilones類似物的產(chǎn)量，但是毫克級(jí)的產(chǎn)量給Epothilones的開發(fā)及應(yīng)用帶來了很大困難［6］。因此，菌種的篩選、選育及發(fā)酵條件的探索仍然是Epothilone B研究者需要研究的重點(diǎn)目標(biāo)之一。

基因組重排（genome shuffling）是一種基于原生質(zhì)體融合，并對(duì)原生質(zhì)進(jìn)行遞推式融合的新型體內(nèi)分子育種方法。2002年，Zhang等［7］首次系統(tǒng)地提出了基因組重排的概念并成功地將該技術(shù)運(yùn)用于快速提高弗氏鏈霉菌合成泰樂菌素的能力。隨后，Gendy等［8］采用基因組重排技術(shù)選育綾霉素的產(chǎn)生菌Nocardia sp. ALAA 2000，選育后綾霉素比起始菌株提高了19倍。Xu等［9］利用該技術(shù)使Trichoderma viride產(chǎn)纖維素酶的能力提高了1.97倍。隨著基因組重排技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，通過基因組重排提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的例子不斷出現(xiàn)，表明該項(xiàng)技術(shù)作為新代謝產(chǎn)物開發(fā)的途徑具有一定的應(yīng)用前景。本研究旨在采用基因組重排技術(shù)改良Epothilone B產(chǎn)生菌，選育出高產(chǎn)Epothilone B的優(yōu)良變異菌株，研究結(jié)果具有一定的理論和實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 親本菌株SC4-14和SC4-56是由纖維堆囊菌AHB125（S. cellulosum AHB125）經(jīng)過紫外誘變和2%乙酸鈉抗性篩選出來并保存的Epothilone B高產(chǎn)菌株［10］。

1.1.2 培養(yǎng)基和溶液 斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基參見參考文獻(xiàn)［10］。

再生固體培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖171.5，MgCl24.273，酪胨3.0，酵母浸膏1.0，CaCl21.0，瓊脂粉16.0，pH7.2-7.4。

HEPES緩 沖 液：HEPES 20 mmol/L，MgCl220 mmol/L，蔗糖0.5 mol/L，pH6.8，滅菌備用。

溶菌酶溶液：稱取0.1 g溶菌酶，加入HEPES緩沖液溶解并定容至10 mL，過濾除菌，4℃保存，使用時(shí)稀釋。

35% PEG4000溶液（W/V）：PEG4000定容于100 mL HEPES緩沖液。

1.2 方法

1.2.1 Epothilone B的發(fā)酵與測(cè)定 Epothilone B的發(fā)酵與測(cè)定見參考文獻(xiàn)［10］。Epothilone B的測(cè)定采用HPLC法，通過Epothilone B的保留時(shí)間和光吸收曲線對(duì)基因組重排后的高產(chǎn)菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的Epothilone B進(jìn)行定性。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備及再生 菌體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期（48 h）時(shí)，加入終濃度為0.01 mol/L EDTA和1%甘氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取一定量培養(yǎng)好的菌液，1 000 r/min離心5 min，取上清液5 000 r/min再離心10 min并收集菌體，HEPES緩沖液洗滌2次，將菌體保存在5 mL HEPES緩沖液中。然后加入溶菌酶液并混勻，使其終濃度為5 mg/mL，37℃水浴保溫酶解破壁1 h，定時(shí)鏡檢。酶解后，3 000 r/min離心10 min并收集原生質(zhì)體，用等體積的HEPES液重懸，振蕩混勻，離心棄上清，再用HEPES液洗滌1次，等體積重懸，與冷卻至45℃左右的上層再生固體培養(yǎng)基混勻，傾入已孵育過夜的再生固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5-7 d，觀察再生情況。

1.2.3 原生質(zhì)體的滅活 紫外線滅活：將原生質(zhì)體溶液移入無菌培養(yǎng)皿中，置于已預(yù)熱穩(wěn)定的15 W紫外燈下，垂直距離為30 cm，分別照射60、70、80、90、100、110和120 s進(jìn)行滅活，經(jīng)HEPES緩沖液10倍系列稀釋后，涂布于再生平板上，30℃避光培養(yǎng)5-7 d，檢查滅活效果。

熱滅活：將原生質(zhì)體溶液置于無菌離心管中，置于溫度分別為55、60、65和70℃水浴鍋中，保溫10、15、20、25和30 min進(jìn)行滅活，經(jīng)HEPES緩沖液10倍系列稀釋后，涂布于再生平板上，30℃避光培養(yǎng)5-7 d后，觀察結(jié)果，檢查滅活效果。

1.2.4 基因組重排 對(duì)親本株SC4-14的原生質(zhì)體進(jìn)行熱滅活，對(duì)親本株SC4-56的原生質(zhì)體進(jìn)行紫外滅活，將滅活的原生質(zhì)體用35% PEG4000（含0.02 mol/L CaCl2）在37℃條件下隨機(jī)融合20 min。然后用5倍體積的HEPES緩沖液稀釋，并3 000 r/min離心5 min，收集原生質(zhì)體后稀釋并涂布于再生培養(yǎng)基上再生，30℃培養(yǎng)3-7 d，全部再生菌落即為F1代融合菌群；將生長旺盛的融合子菌落轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，檢測(cè)發(fā)酵液中Epothilone B的含量，產(chǎn)量提高的突變株為第1輪融合株F1，再將產(chǎn)量較高的優(yōu)良菌株（F1）進(jìn)行下一輪原生質(zhì)體制備、滅活、融合與篩選，所得突變株即F2。如此反復(fù)進(jìn)行4 輪循環(huán)原生質(zhì)體融合、再生，不同融合子代標(biāo)記為F1、F2、F3和F4，同時(shí)以原始菌株做對(duì)照。

1.2.5 突變菌株遺傳穩(wěn)定性的測(cè)定 將生產(chǎn)能力較高的幾株菌接種至固體培養(yǎng)基中傳代10次并進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，檢測(cè)Epothilone B的含量，選擇遺傳穩(wěn)定性較好、產(chǎn)量穩(wěn)定的重組菌株作為高產(chǎn)重組菌株。

1.2.6 發(fā)酵過程曲線的測(cè)定 將親本菌株與基因重排后的菌株種子液以10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，分別于發(fā)酵的第1、2、3、4、5、6、7和8天取樣，分別測(cè)定其菌體生長曲線和EpothiloneB含量，繪制其發(fā)酵過程曲線。其中生長曲線采用分光光度計(jì)測(cè)定在OD600下的吸光值，EpothiloneB含量測(cè)定采用HPLC法。

2 結(jié)果

2.1 原生質(zhì)體的制備和再生

在試驗(yàn)過程中需要對(duì)原生質(zhì)體制備的影響條件進(jìn)行考察。經(jīng)過前期的研究確定溶菌酶最終質(zhì)量濃度為4 mg/mL、酶解溫度為37℃、酶解時(shí)間為60 min，在此條件下原生質(zhì)體的形成率和再生率最高。

2.2 原生質(zhì)體滅活

2.2.1 熱滅活原生質(zhì)體 從表1 可見，當(dāng)菌株SC4-14原生質(zhì)體在70℃恒溫水浴中處理20 min 時(shí)，原生質(zhì)體致死率達(dá)到100%。但當(dāng)溫度超過65℃時(shí)，原生質(zhì)體容易黏結(jié)成團(tuán)，不利于原生質(zhì)體的融合。因此，本試驗(yàn)確定60℃、處理25 min 作為Epothilone B產(chǎn)生菌原生質(zhì)體熱滅活的條件。

表1 熱滅活時(shí)間和溫度對(duì)SC4-14原生質(zhì)體致死率的影響

2.2.2 紫外線滅活原生質(zhì)體 從圖1可以看出，當(dāng)紫外線照射SC4-56的原生質(zhì)體時(shí)間為110 s 時(shí)，原生質(zhì)體致死率為100%。因此，選用紫外線照射110 s 作為Epothilone B產(chǎn)生菌原生質(zhì)體紫外滅活的處理時(shí)間。

圖1 紫外線滅活時(shí)間對(duì)SC4-56原生質(zhì)體致死率的影響

2.3 基因組重排

為獲得更多重排的正突變基因組合，選用兩個(gè)親株SC4-14和SC4-56作為基因重排的出發(fā)親本，這2個(gè)親本是由S. cellulosum AHB125經(jīng)過紫外誘變和2%乙酸鈉抗性篩選而獲得的。經(jīng)過4輪基因組重排試驗(yàn)后，獲得62株生長速度較快的菌株，對(duì)得到的重排菌株進(jìn)行產(chǎn)量測(cè)定，得到8株產(chǎn)量相對(duì)較高的重組菌株。從圖2中可以看出，原始菌株S. cellulosum AHB125 Epothilone B的產(chǎn)量為8.2 mg/L，制備原生質(zhì)體的兩株親本菌株SC4-14和SC4-56的Epothilone B產(chǎn)量分別為13.6 mg/L和14.5 mg/L。獲得的8株高產(chǎn)菌株其Epothilone B的產(chǎn)量都是SC4-14和SC4-56菌株的2倍以上，并且菌落形態(tài)和顏色與起始菌株相比沒有發(fā)生明顯變化。其中F4-13（58.8 mg/L） 和F4-28（67.4 mg/L）的產(chǎn)量最高，Epothilone B的產(chǎn)量是SC4-14菌株產(chǎn)量的4.3倍和5.0倍，是SC4-56菌株產(chǎn)量的4.1倍和4.6倍，是原始菌株纖維堆囊菌AHB125 Epothilone B產(chǎn)量的8倍。

圖2 基因組重排篩選結(jié)果

2.4 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將篩選出的8株高產(chǎn)菌株連續(xù)傳代10次后，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，以搖瓶的產(chǎn)量作為篩選的指標(biāo)，結(jié)果（表2）顯示，傳代后的菌株發(fā)酵產(chǎn)量沒有明顯下降，表明篩選到的重排菌株的高產(chǎn)性狀遺傳特性較穩(wěn)定。F4-6、F4-45和 F4-56的產(chǎn)量有明顯下降，其遺傳穩(wěn)定性差；而其它5株的遺傳性穩(wěn)定性較好，其中F4-28的產(chǎn)量最高，Epothilone B的產(chǎn)量一直穩(wěn)定在67 mg/L左右。

表2 重組菌株的Epothilone B產(chǎn)量（mg/L）

2.5 菌株SC4-56和F4-28在10 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵過程比較

將親本菌株之一SC4-56和重排菌株F4-28在10 L發(fā)酵罐上分別進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，其發(fā)酵過程曲線如圖3所示。兩種菌株在發(fā)酵過程中的生長曲線大致相似，都在第3天達(dá)到菌體的最大值，但重排菌株F4-28的細(xì)胞密度要大于親本菌株，并提前進(jìn)入衰亡期。在Epothilone B積累過程中，兩者在發(fā)酵罐中的產(chǎn)量都比在搖瓶中要高約10%，SC4-56在第6天產(chǎn)物達(dá)到最大值（18.5 mg/L），而F4-28在發(fā)酵的第5天達(dá)到最大值（75.2 mg/L），比親本菌株的發(fā)酵周期要短1 d。因此，重排菌株F4-28在發(fā)酵生產(chǎn)上更易于提高發(fā)酵罐的利用效率。

圖3 SC4-56和F4-28在10 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵過程曲線

3 討論

采用物理、化學(xué)方法來提高Epothilone B產(chǎn)量的傳統(tǒng)誘變育種方法存在誘變效率低、篩選工作量大、周期長、重復(fù)誘變過程造成一些無關(guān)的或負(fù)向突變的積累等缺點(diǎn)，很難大幅度提高Epothilone B產(chǎn)量；而由于黏細(xì)菌的特殊性，通過基因工程提高Epothilone B的方法很少被研究［11］?；蚪M重排技術(shù)是一種多親本遞歸式原生質(zhì)體融合技術(shù)，親本菌株在全基因組的不同位置上同時(shí)發(fā)生重組，發(fā)生多交換和多基因重組，最終使不同的正向基因重組到同一個(gè)細(xì)胞株中，因此相對(duì)容易大幅度提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，是改善工業(yè)微生物表型的直接而有效的方法［12］。另外，尤其適用于微生物的代謝途徑、編碼生物合成酶的基因以及基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制不清楚的代謝產(chǎn)物。與傳統(tǒng)的理化誘變方法相比，基因組重排技術(shù)可更快速、高效地篩選出表型優(yōu)良的菌株，且在篩選庫的建立過程中剔除了負(fù)突變，彌補(bǔ)了經(jīng)典誘變方法負(fù)突變的缺陷［13］。

本研究中采用熱滅活和紫外滅活兩種方式處理原生質(zhì)體，然后再融合，這樣避免了同種滅活方式造成的相同部位發(fā)生損傷的缺陷，使不同菌株間染色體不同部位的致死損傷可以得到互補(bǔ)，從而提高了重組的效率。本研究首次嘗試采用基因組重排技術(shù)改良纖維堆囊菌AHB125，獲得一株遺傳性能穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株F4-28，Epothilone B的產(chǎn)量達(dá)到了67.4 mg/L，是原始菌株纖維堆囊菌AHB125的8倍，是兩親本菌株SC4-14和SC4-56的5倍。因此，采用基因組重排技術(shù)是一種有效的提高Epothilone B產(chǎn)量的方法。雖然本研究取得了很大的進(jìn)步，但是Epothilone B的產(chǎn)量與目前已報(bào)道菌株S. cellulosum So0157-2的產(chǎn)量（104 mg/L）相比還有較大差距［14］。這主要是因?yàn)楸狙芯克玫木陙碓磁c其不同，纖維堆囊菌AHB125是由本實(shí)驗(yàn)室研究人員從自然界中分離并鑒定的，其初始產(chǎn)量很低，并且前期的菌種選育研究的較少，而S. cellulosum So0157-2已經(jīng)過多次誘變。因此，在下一步的工作中，應(yīng)該把基因組重排與其它誘變育種技術(shù)聯(lián)合使用，Epothilone B的產(chǎn)量可能會(huì)更高。同時(shí)，本研究也再次證明了基因重排技術(shù)在菌種選育中的有效性及高效性，同時(shí)為應(yīng)用該技術(shù)選育高產(chǎn)Epothilone B菌株和研究Epothilone B的代謝調(diào)節(jié)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

采用基因組重排的方法對(duì)Epothilone B產(chǎn)生菌纖維堆囊菌SC4-14和SC4-56進(jìn)行菌株選育，獲得5株目標(biāo)物質(zhì)產(chǎn)量較高并且遺傳性能穩(wěn)定的變異菌株，其中最優(yōu)菌株F4-28的Epothilone B產(chǎn)量達(dá)到了67.4 mg/L，是兩親本菌株SC4-14和SC4-56的5倍，通過比較該菌株與親本菌株之一SC4-56的發(fā)酵過程，F(xiàn)4-28的Epothilone B產(chǎn)量在第5天達(dá)到最大值，比SC4-56的發(fā)酵周期少1 d，可以縮短發(fā)酵周期。

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