梁俊婷 李鹿之 陳少鵬 焦湞

（1.鄭州大學(xué) 離子束生物工程省重點實驗室，鄭州 450052；2.中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院技術(shù)生物與農(nóng)業(yè)工程研究所，合肥 230031）

自1962年Shimomura等［1］首次從維多利亞多管水母（Aequoria victoria）中分離出綠色熒光蛋白（avGFP）后，到目前為止，通過一系列體外分子進化的手段發(fā)展出幾乎覆蓋整個熒光光譜的GFP突變體，如藍(lán)色（Blue）、青色（Cyan）、黃色（Yellow）熒光蛋白［2-5］。綠色熒光蛋白主要作為報告基因應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。然而，1997年Abedi等［6］將20個氨基酸殘基的短肽插入到GFP松散的Loop位點處，其中大部分插入的位點都嚴(yán)重影響熒光蛋白的折疊和發(fā)光，但同時篩選出了少數(shù)合適的插入位點，在插入外源短肽后仍能正常發(fā)射熒光。這種體外進化GFP的方式不同于以往改造GFP的方式，傳統(tǒng)的方法主要采用一輪或多輪的點突變改造GFP熒光蛋白。隨后，Baird等［7］對增強型綠色熒光蛋白（EGFP）的每一個位點做了更為系統(tǒng)和精確的篩選，其可插入外源短肽的位點基本上與GFP保持一致，但是其他的熒光蛋白或者GFP突變體是否也具有類似的或不同的耐受外源短肽插入的位點呢？

1999年，紅色熒光蛋白drFP583［8］（商品名是DsRed，558 nm/583 nm）首次被發(fā)現(xiàn)，極大豐富了熒光蛋白的光譜多樣性。較之GFP及其突變體，紅色熒光蛋白drFP583的激發(fā)和發(fā)射波長大大增加，而且具有在組織成像方面背景熒光低等諸多優(yōu)勢。因此，紅色熒光蛋白引起了研究人員的廣泛關(guān)注。但是野生型的drFP583體內(nèi)外均易形成四聚體且成熟速度慢［9］，這些缺陷極大限制了它在生物學(xué)上的應(yīng)用。為了克服這些缺點，研究人員隨后通過多輪的隨機突變和定點突變改造，在2002年首次得到了紅色熒光蛋白drFP583的單體mRFP1［10］。與野生型drFP583相比，mRFP1具有更長的激發(fā)和發(fā)射波長（584 nm/607 nm），其熒光亮度更強，成熟速度更快。在mRFP1的基礎(chǔ)上，Shaner等［11］通過多輪隨機和定點突變得到了mCherry。優(yōu)化后的mCherry比mRFP1熒光亮度更亮，成熟時間更短，激發(fā)和發(fā)射波長更長（587 nm/610 nm）。因其諸多優(yōu)良性能，mCherry備受研究人員的青睞。

已有研究表明mCherry類似GFP，可以插入外源短肽［12］。為了獲得更多的更合適的插入位點，本研究使用mCherry為靶熒光蛋白，旨在通過轉(zhuǎn)座子的突變系統(tǒng)尋找mCherry中可供外源短肽插入的位點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans I及質(zhì)粒pUC19均購自北京全式金生物公司。LB培養(yǎng)基、SOC培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基配方參考分子克隆實驗指南（第3版）。LB/Agar/Amp培養(yǎng)基（Amp終濃度是200 μg/mL），LB/Agar/Amp/Kan培養(yǎng)基（Amp終濃度是200 μg/mL，Kan終濃度為10 μg/mL）。

1.1.2 主要的試劑 Not I 、EcoR I 和Sal I限制性酶以及DNA Ladder Marker購買于TaKaRa公司。高保真酶KOD Plus 購自ToYoBo公司。普通Taq酶購自北京TIANGEN生物公司。IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）貯存濃度為100 mmol/L，工作濃度為1 mmol/L。T4連接酶購自NEB公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均為Axygen公司產(chǎn)品。寡核苷酸引物合成和DNA測序由上海生工生物公司完成。轉(zhuǎn)座子隨機突變試劑盒Mutation Generation SystemTMKit（F-701）購自Finnzymes公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 用于擴增mCherry的上下游引物分 別 為：F：5'-TCAGACGAATTCGGTACCGGCGGC TCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG-3'，R：5'-AG ATTGTCGACGGTACCGCCCTTGTACAGCTCGTCCATG CCGC-3'。分別在上游引物加上限制酶EcoR I，下游引物加上限制酶Sal I，mCherry經(jīng)PCR擴增后，經(jīng)EcoR I 和Sal I 酶切。回收mCherry酶切片段連接到經(jīng)EcoR I 和Sal I 酶切的質(zhì)粒pUC19上，得到重組質(zhì)粒pUC-MC。轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans I中，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pUC-MC。

1.2.2 以轉(zhuǎn)座子試劑盒為基礎(chǔ)的突變體系統(tǒng) 按照轉(zhuǎn)座子隨機突變試劑盒Mutation Generation SystemTMKit說明書，使用具有Kan抗性的MuA轉(zhuǎn)座子進行體外轉(zhuǎn)座反應(yīng)。將自身DNA隨機轉(zhuǎn)座到已經(jīng)構(gòu)建好的質(zhì)粒pUC-MC（靶DNA）上。體外轉(zhuǎn)座反應(yīng)體系按照說明書要求，在1.5 mL的離心管中分別加入1 μL轉(zhuǎn)座子，120 ng目的DNA（質(zhì)粒pUC-MC），4 μL Buffer，1 μL MuA轉(zhuǎn)座酶，最后加入超純水至終體積20 μL。輕輕混勻后30℃反應(yīng)1 h，75℃水浴10 min，滅活MuA轉(zhuǎn)座酶。

1.2.3 mCherry 及其突變體的獲得 取2 μL轉(zhuǎn)座酶體外轉(zhuǎn)座反應(yīng)系統(tǒng)的反應(yīng)混合物，加入到50 μL Trans I感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后涂布在LB/Agar/Amp培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)過夜。收集所有的細(xì)菌克隆后提取質(zhì)粒。EcoR I 和Sal I 酶切后，瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)生4條明亮且大小不同的條帶（圖1-A）。這4條帶大小分別為3.8 kb（2.7 kb質(zhì)粒+1.1 kb轉(zhuǎn)座子），2.7 kb（空質(zhì)粒），1.8 kb（0.7 kb mCherry +轉(zhuǎn)座子）和0.7 kb（mCherry）。回收1.8 kb和2.7 kb的條帶，連接后轉(zhuǎn)化，涂板，37℃培養(yǎng)過夜后，收取所有克隆，最終得到在mCherry中插入轉(zhuǎn)座子的細(xì)菌庫，提質(zhì)粒，得到pUC-MC/TS。由于轉(zhuǎn)座子序列兩端均含有特定的Not I酶切位點，質(zhì)粒pUC-MC/TS 經(jīng)Not I酶切后，轉(zhuǎn)座子基因基本被切除，僅留下包括Not I酶切位點在內(nèi)的15 個堿基，得到質(zhì)粒pUC-MC/15 bp。

1.2.4 mCherry及其突變體的誘導(dǎo)表達(dá) 將構(gòu)建好的質(zhì)粒系統(tǒng)pUC-MC/TS和pUC-MC/15 bp分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans I，在含有200 μg/mL Amp或（和）10 μg/mL Kan的TB培養(yǎng)液中，37℃，180 r/min條件下培養(yǎng)12 h。然后將菌液1∶50接種在含有相應(yīng)抗生素的TB培養(yǎng)液中，在37℃，180 r/min下培養(yǎng)菌液直到OD600達(dá)到0.4。加入IPTG誘導(dǎo)使其終濃度為1 mmol/L，在16℃，180 r/min條件下誘導(dǎo)mCherry熒光蛋白，8 h后流式細(xì)胞儀檢測其熒光變化。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測及分選 將誘導(dǎo)后表達(dá)mCherry的菌液12 000 r/min離心去上清，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍。調(diào)整菌液OD600值為0.2后，用AriaIII流式細(xì)胞儀（BD）進行分選和檢測（激發(fā)波長：561 nm，發(fā)射波長：610 nm）。3次平行試驗后，根據(jù)其相對熒光強度，觀察突變體相對于野生型mCherry的熒光變化。

1.2.6 mCherry突變體測序 在流式細(xì)胞儀分選陽性菌液培養(yǎng)后挑取單克隆菌斑，測序。各測序結(jié)果與mCherry序列比對后確認(rèn)有15個堿基插入到mCherry序列即可認(rèn)定為陽性克隆。

1.2.7 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)來自至少3次重復(fù)試驗，結(jié)果的表示方法為：x-±s。數(shù)據(jù)組之間的顯著性分析用 students’t test方法，P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 mCherry短肽插入突變體庫的構(gòu)建

利用轉(zhuǎn)座子隨機突變系統(tǒng)將轉(zhuǎn)座子（Kan抗性）隨機插入到質(zhì)粒pUC-MC，使用mCherry兩端特定的限制酶EcoR I和Sal I 酶切后得到4條不同大小的DNA片段（圖1-A），將含有轉(zhuǎn)座子序列的mCherry片段（1.8 kb）連接到pUC19片段（2.7 kb）上得到突變體庫pUC-MC/TS（圖1-B）。在此突變體庫的基礎(chǔ)上，使用限制酶Not I切除突變體pUC-MC/TS上的轉(zhuǎn)座子序列，在原位置殘留15個堿基。這樣便得到15個堿基僅插入到mCherry序列的質(zhì)粒突變體庫pUC-MC/15 bp（圖1-C）。

圖1 突變體庫pUC-MC/TS和pUC-MC/15 bp的構(gòu)建

2.2 mCherry短肽突變體的篩選

適當(dāng)?shù)臈l件下誘導(dǎo)表達(dá)mCherry短肽突變體后，使用流式細(xì)胞分選儀（ArialIII，BD）分選出陽性細(xì)菌（圖2），表達(dá)紅色熒光蛋白的大腸桿菌如圖2-B P3所示。擴大培養(yǎng)后，即獲得插入短肽后仍發(fā)熒光的突變體群。

2.3 mCherry短肽突變體的獲得

將流式細(xì)胞儀分選出的陽性菌培養(yǎng)后涂板，挑取單克隆后測序。測序的各突變體序列與原始mCherry序列比對后，確定15個堿基插入到mCherry序列及其插入位置，然后分析其在熒光蛋白mCherry二級結(jié)構(gòu)中的插入位置。

測序結(jié)果顯示，有15個堿基插入到mCherry序列的克隆共有53個，占所有測序的單克隆總數(shù)（85個）的64%，即篩選mCherry短肽突變體的陽性率約64%。同時，共有13個mCherry短肽突變體誘導(dǎo)后仍發(fā)射紅色熒光，其插入位置分別位于mCherry氨基酸序列的第K9、E10、F11、F65、G90、G116、K121、E148、M150、L157、G171、V187和T223氨基酸殘基位置處，分別簡稱為m9、m10、m11、m65、m90、m116、m121、m148、m150、m157、m171、m187和m223（圖3）。

圖2 流式細(xì)胞儀篩選誘導(dǎo)后表達(dá)質(zhì)粒突變體pUC-MC/15bp的大腸桿菌

圖3 5個外源氨基酸所在mCherry二級結(jié)構(gòu)中相應(yīng)氨基酸殘基的位置（方框所示）

2.4 mCherry短肽突變體熒光亮度的測定

將上述13個mCherry短肽突變體及野生型mCherry在相同誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)后，流式細(xì)胞儀檢測它們在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)。mCherry短肽突變體的熒光亮度與野生型mCherry（未插入的熒光強度為100%）相比明顯減弱（圖4）。

3 討論

圖4 質(zhì)粒突變體pUC-MC/15bp中15個堿基插入mCherry序列的氨基酸位數(shù)對應(yīng)mCherry突變體的相對熒光強度

Mu噬菌體是目前研究DNA轉(zhuǎn)座的理想模型之一，其轉(zhuǎn)座機理［13］已有詳盡報道。本研究采用MuA轉(zhuǎn)座酶催化的轉(zhuǎn)座子突變系統(tǒng)，將轉(zhuǎn)座子隨機插入到熒光蛋白mCherry中，經(jīng)轉(zhuǎn)座子兩端特定的Not I 限制酶切后，剩余15個堿基殘留在mCherry序列中。但是，15個堿基插入到mCherry序列后，熒光蛋白mCherry的熒光大部分都已經(jīng)消失，只有在若干個特定位點處mCherry仍保留較強熒光。這些特定的位點主要分布在N/C末端，第3、4個β折疊之間，第5、6個β折疊之間，第8、9個β折疊之間，第9、10個β折疊之間以及第6、7、8個β折疊上。Li等［12］證明了mCherry可耐受外源短肽插入的位點主要分布在第1、2個β折疊之間，第6、7個β折疊之間，第9、10個β折疊之間，但認(rèn)為最耐受插入外源肽段的位點是在第9、10個β折疊之間的Loop結(jié)構(gòu)。本研究顯示，雖然在第9、10個β折疊之間的Loop結(jié)構(gòu)（第187位氨基酸殘基）處的突變體m187仍能發(fā)出56%的相對熒光，但并無充分的證據(jù)證實此Loop結(jié)構(gòu)最耐受外源肽段的插入。第9、10個β折疊之間的Loop中第V187位氨基酸殘基處插入的m187突變體的熒光強度與插入其他Loop結(jié)構(gòu)處的突變體短肽相比熒光最亮；第5、6個β折疊之間的熒光蛋白突變體亮度最低，約為野生型mCherry熒光亮度的15%。因此本研究證明此Loop結(jié)構(gòu)中耐受外源短肽插入的程度較弱。

另外，本研究在β折疊上也篩選出4個不同的插入位點，與插入到松散的Loop結(jié)構(gòu)中的各個位點相比，熒光蛋白突變體的亮度總體降低。但在第7個β折疊上有兩個位點處（第E148和M150位）的熒光蛋白突變體均能發(fā)出較亮的熒光。這說明與其他β折疊相比，這兩個位點處或其附近的位點耐受度較強。迄今為止，仍未有相關(guān)的文獻報道，系統(tǒng)篩選出熒光蛋白mCherry的β折疊上所有耐受外源短肽插入的位點。本研究使用突變轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，首次將β折疊柱上可插入位點系統(tǒng)的篩選出來，共有4個可插入位點。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，位于熒光蛋白mCherry的發(fā)色體（MYG）附近的第F65位突變體m65，熒光強度約為原來的52%。

本研究證明的可插入位點不僅包括已有相關(guān)報道的附近位點，如V187處與Li等［12］報道的K184位都在第9、10個β折疊柱之間的Loop結(jié)構(gòu)，而且證實了更多不同的位點，這極大地增加了熒光蛋白mCherry中可插入的位點的數(shù)目，為試驗的進一步設(shè)計（如熒光雙分子互補技術(shù)）提供更多可選擇的位點。同時，也為改造熒光蛋白作為生物感受器或者插入更長外源短肽提供了更多可參考的位點。

4 結(jié)論

采用轉(zhuǎn)座子隨機突變系統(tǒng)最終將5個氨基酸短肽隨機到熒光蛋白mCherry中，共篩選出13個特定插入位點。這些插入外源短肽的mCherry突變體仍然能發(fā)出較強的熒光，其中第9、10個β折疊柱間的Loop結(jié)構(gòu)耐受外源短肽插入的能力較強；相反，在第5、6個β折疊柱間耐受度較弱。

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