梁玲玲

(浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠 浙江紹興 312500)

從自然界獲得的野生菌種,無論在數(shù)量上還是質(zhì)量上都無法滿足人類對其需要,因此,對產(chǎn)自于自然界具有某種代謝工程的菌種進(jìn)行分析、篩選已經(jīng)成為微生物工程必經(jīng)環(huán)節(jié),菌種選育為人們的生產(chǎn)、生活提供了各種各樣的產(chǎn)品。紫外線是一種最常用有效的物理誘變因素,其誘變效應(yīng)主要是由于它引起DNA結(jié)構(gòu)的改變而形成突變型。紫外線誘變,一般采用15W或30W紫外線燈,照射距離為20-30cm,照射時間依菌種而異,一般為1-3min,死亡率控制在50%-80%為宜。被照射處理的細(xì)胞,必須呈均勻分散的單細(xì)胞懸浮液狀態(tài),以利于均勻接觸誘變劑,并可減少不純種的出現(xiàn)。所以利用紫外誘變可以說是選育高產(chǎn)的菌株是一個很有效的方法[1]。

輔酶q10又稱泛醌(Ubiquinone,縮寫UQ),是一種存在于自然界的脂溶性醌類化合物,其結(jié)構(gòu)與維生素K、維生素E與質(zhì)體醌相似。在人類身體細(xì)胞內(nèi)參與能量制造及活化,是預(yù)防動脈硬化形成最有效的抗氧化成份是一種脂溶性抗氧化劑,是人類生命不可缺少的重要元素之一,能激活人體細(xì)胞和細(xì)胞能量的營養(yǎng),具有提高人體免疫力、增強(qiáng)抗氧化、延緩衰老和增強(qiáng)人體活力等功能,醫(yī)學(xué)上廣泛用于心血管系統(tǒng)疾病,國內(nèi)外廣泛將其用于營養(yǎng)保健品及食品添加劑。

強(qiáng)大的市場促使很多制藥企業(yè)生產(chǎn)這個產(chǎn)品,而目前生產(chǎn)輔酶q10主要是通過生物發(fā)酵,但是生物發(fā)酵有個缺點就是生產(chǎn)成本高,發(fā)酵產(chǎn)率低,所以選育高產(chǎn)菌株,是提高輔酶q10產(chǎn)量的主要手段。而本文著就重研究了紫外誘變對于選育輔酶q10高產(chǎn)菌株是否有促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 出發(fā)菌種

輔酶q10菌種[2](球型紅假單胞菌),超低溫冰箱貯藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基[3]:瓊脂20g,葡萄糖15g,酵母粉5g,Nacl 4.2g,碳酸鈣38g,加水至1000ml。ph調(diào)至4.5。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖3%,玉米漿干粉0.05%,Nacl2%,碳酸鈣3%,酵母粉0.15%,MgSO40.8%,(NH4)SO45%。ph調(diào)至7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基:MgSO42%,(NH4)SO42%,葡萄糖8%,Nacl0.5%,KH2PO41%,玉米漿干粉10%。ph調(diào)至7.0。

1.3 操作方法

表1

將菌種稀釋7倍后均勻的涂在斜面培養(yǎng)基上,然后將斜面培養(yǎng)基放在溫度35℃,濕度50%的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)8-9天。菌孢子用20%的無菌水洗下,接入裝量為110ml的250ml的三角燒瓶中(內(nèi)含玻璃珠),搖床振蕩30min,然后用生理鹽水離心洗2次,再稀釋8倍,制成懸浮液。

1.4 紫外誘變過程

將稀釋過的懸浮液分別放置在直徑6cm的培養(yǎng)皿中,接著把培養(yǎng)皿放置在離紫外燈30cm遠(yuǎn)的攪拌器上,分別振蕩照射0s,30s,60s,90s,120s,150s,180s。然后在超凈工作臺上進(jìn)行平板涂布,涂布完后在溫度為35℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)72h,培養(yǎng)箱必須處在黑暗環(huán)境中,而它的對照組是用沒有進(jìn)行紫外照射的懸浮液制成的平皿,在相同的條件下也培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行菌落計數(shù),并計算致死率。

1.5 培養(yǎng)條件

在進(jìn)行完菌落計數(shù)的平皿中挑選生長快,菌落大的單菌落接入種子培養(yǎng)基中,在溫度為31℃,搖床轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下培養(yǎng)24h,然后按5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,在溫度34℃,搖床轉(zhuǎn)速為230r/min的條件下再培養(yǎng)72h[4]。培養(yǎng)結(jié)束后檢測含量。

1.6 檢測方法

在波長為660nm的可光分光光度計下測菌濃。

高效液相色譜測輔酶q10含量 色譜波長275nm 進(jìn)量為20ul

2 結(jié)果(表1)

3 結(jié)果分析

通過一系列的準(zhǔn)備,我們對球型紅假單胞菌進(jìn)行了紫外誘變,通過與對照組進(jìn)行比較,可以發(fā)現(xiàn)紫外照射120s時誘變的效果最好,其中它的輔酶q10含量提高了11%,存活率提高了15%。所以可以分析出菌體經(jīng)過紫外照射后,有些瀕臨死亡的菌種通過修復(fù),提高了存活率,也相應(yīng)提高了突變菌株的出現(xiàn)率,篩選出的菌株大大提高了輔酶q10的含量,有此可以看出紫外誘變選育對挑選高產(chǎn)菌株起了很大的促進(jìn)作用。

[1]李義勇,張亞雄.基因重組技術(shù)在工業(yè)微生物菌種選育中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].中國釀造,2009(1).

[2]尹鵬,魏寶東.雙重抗性篩選輔酶Q_(10)高產(chǎn)菌株[J].食品工業(yè)科技,2012(7).

[3]陳瑜.發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Q_(10)的含量分析及工藝優(yōu)化[J].科技通報,2002(4).

[4]黨磊,靳明慧,田菁,王瑋,王小雪,龐欣.類球紅細(xì)菌突變株及其應(yīng)用[J].生命科學(xué)儀器,2010(6).